棉花抗黄萎病基因GhERF的功能分析和抗黄萎病相关基因GhHRGP的转化研究

论文摘要

黄萎病是一种难以防治的土传性维管束病害,严重影响棉花的生产,通过常规杂交育种的方法难以获得既抗黄萎病又具有优良农艺性状的品种。利用分子生物学技术分离、研究棉花抗黄萎病相关基因,再通过转基因技术使棉花获得抗黄萎病的功能和性状,是一条具有发展前景的途径。本研究中两个抗黄萎病相关基因GhERF（Gossypium hirsutum Ethylene Responsive Factor gene）和GhHRGP（Gossypium hirsutum Proline-Rich Glycoprotein gene）的全长cDNA序列,是本实验室利用黄萎病菌毒素诱导棉花幼苗克隆所得。氨基酸序列比对表明,GhERF属于植物中特有的乙烯转录因子家族,与拟南芥中乙烯应答元件结合蛋白AtEBP（Ethylene-Responsive Element BindingProtein）的同源性达45%,在结构上类似于拟南芥ERF家族中的B-2亚家族。GhHRGP可能参与植物细胞壁蛋白的组成,其成分与富含羟脯氨酸糖蛋白（Hydroxyproline-Rich Glycoprotein）相近。以乙烯利处理耐黄萎病陆地棉品种中棉12的7日龄幼苗,采用半定量RT-PCR研究了GhERF和GhHRGP受乙烯诱导的表达情况。结果表明,GhERF在根部组织呈现近于组成型表达的特征,其表达水平与对照相比没有明显变化,而在叶片组织中本底表达水平较低,乙烯处理后2h至12h表达水平显著上调,说明GhERF在根部和叶片中具有不同的组织表达特性,其在叶片组织中的表达水平受乙烯的影响较大。GhHRGP在对照组根部和叶片中各时间段均未检测到表达,受乙烯利处理后也检测不到表达,表明GhHRGP在根部和叶片组织中的表达不受乙烯的诱导。构建了GhERF和GhHRGP两个基因的植物表达载体,采用农杆菌介导法分别对棉花（中棉所24、中棉所394和冀合713）和拟南芥（Col-0）进行了GhERF和GhHRGP的遗传转化。GhHRGP转化棉花（中棉所24）获得了8个胚芽;GhERF转化Col-0获得了GhERF过表达的转基因拟南芥植株纯合子。为验证在拟南芥上进行棉花抗病相关基因抗病性鉴定,采用多种方法研究了棉花黄萎病菌VD991的毒素和孢子悬浮液对拟南芥Col-0、Nd-1、C24和WS四个生态型的致病情况,建立了研究黄萎病菌和拟南芥相互作用的实验平台。研究结果表明,毒素幼苗鉴定和成株针刺接种适合进行转基因拟南芥对黄萎病菌的抗病性研究。在毒素对无菌幼苗鉴定中,发现在10μg/ml～20μg/ml的毒素范围内四种生态型的拟南芥幼苗表现出不同程度的叶片萎蔫、褪绿的症状,其中Nd-1和C24对毒素最为敏感,Col-0敏感程度中等,WS对毒素相对不敏感。以孢子悬浮液针刺接种成株叶片后,会出现不同程度的萎蔫、褪绿和黄化等黄萎病症状。以GhERF转基因拟南芥纯合子植株为材料,采用毒素法鉴定了转基因植株对大丽轮枝菌的抗性并对GhERF的调控功能进行了分析。在浓度为12.5μg/ml的条件下对GhERF过表达的转基因拟南芥植株纯合子进行的毒素抗病鉴定表明,转基因植株和野生型均出现叶片萎蔫的症状,统计结果病株率分别为50%和71%,病情指数分别为12.5%和30.9%。表明GhERF基因的过表达提高了转基因植株对毒素的耐受性。对文献报道的受GhERF调控的8个下游防卫基因进行半定量RT-PCR检测表明,除PR1和Thi2.1的表达水平与对照相比没有变化之外,PR2、PR3、PR4、PDF1.2、PRXR1和Di19 6个基因的表达水平均表现上调,其中PDF1.2、PR3和PR4的表达水平上调显著,说明GhERF具有调控乙烯信号途径下游防卫基因表达的功能,而对水杨酸信号途径和茉莉酸信号途径下游防卫基因PR1和Thi2.1的表达可能没有影响。这表明GhERF是一个参与乙烯信号转导途径并具有调控植物防卫反应功能的重要抗黄萎病候选基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 黄萎病菌的真菌学和致病机理
• 1.1.1 黄萎病菌的真菌分类学地位
• 1.1.2 黄萎病菌的致病机理
• 1.1.3 黄萎病菌的致病因子
• 1.2 植物的防卫反应机制
• 1.2.1 针对寄生营养型病原菌的防卫反应
• 1.2.2 针对腐生营养型病原菌的防卫反应
• 1.3 抗黄萎病相关基因的分离与克隆
• 1.4 乙烯信号转导途径与其它防卫信号途径的"交谈"作用
• 1.4.1 基因对基因抗性信号转导途径
• 1.4.2 水杨酸信号转导途径
• 1.4.3 茉莉酸信号转导途径
• 1.4.4 诱导系统抗性信号转导途径和脱落酸信号途径
• 1.5 乙烯转录因子在植物防卫反应中的作用
• 1.5.1 乙烯转录因子家族
• 1.5.2 乙烯转录因子对下游防卫基因的调控
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 棉花抗黄萎病相关基因GhERF和GhHRGP的表达特性及同源性聚类分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 病原菌和棉花材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大丽轮枝菌的培养及粗毒素的制备
• 2.2.2 棉花材料的培养及处理方法
• 2.2.3 棉花材料总RNA的提取
• 2.2.4 去除总RNA中的基因组DNA
• 2.2.5 第一链cDNA的合成
• 2.2.6 RT-PCR检测棉花抗病相关基因
• 2.2.7 半定量RT-PCR检测表达量
• 2.2.8 蛋白质序列比对和同源性聚类分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 GhERF和GhHRGP的毒素诱导表达
• 2.3.2 GhERF和GhHRGP的乙烯诱导表达
• 2.3.3 GhERF氨基酸序列的进化分析
• 2.3.4 GhHRGP氨基酸序列的进化分析
• 2.4 讨论
• 第三章 GhERF和GhHRGP植物表达载体的构建和GhHRGP遗传转化的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 受体材料
• 3.1.2 菌株和载体
• 3.1.3 所用试剂
• 3.1.4 所用仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 植物表达载体的构建
• 3.2.2 棉花受体材料幼苗的培养
• 3.2.3 农杆菌菌株的培养
• 3.2.4 农杆菌菌株对棉花组织的侵染
• 3.2.5 棉花愈伤组织的诱导
• 3.2.6 棉花胚性愈伤组织的诱导
• 3.2.7 胚状体的培养
• 3.3 结果
• 3.3.1 GhERF植物表达载体的构建
• 3.3.2 GhHRGP植物表达载体的构建
• 3.3.4 获得了GhHRGP转基因棉花的胚状体和胚芽
• 3.4 讨论
• 第四章 棉花黄萎病菌对拟南芥的致病性
• 4.1 材料
• 4.1.1 病原菌
• 4.1.2 寄主植物
• 4.1.3 所用试剂
• 4.1.4 所用仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 病原菌的培养和拟南芥的培养
• 4.2.2 拟南芥的种植和移植
• 4.2.3 粗提毒素的制备
• 4.2.4 黄萎病菌孢子悬浮液的浓度测定
• 4.2.5 对拟南芥进行毒素处理和接种孢子悬浮液
• 4.3 结果
• 4.3.1 大丽轮枝菌毒素对拟南芥幼苗的致病性
• 4.3.2 叶片针刺接种孢子悬浮液的结果
• 4.3.3 伤根接种孢子悬浮液的结果
• 4.4 讨论
• 第五章 GhERF转基因拟南芥植株的获得和功能分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 农杆菌菌株
• 5.1.2 拟南芥受体材料
• 5.1.3 病原菌材料
• 5.1.3 所用试剂
• 5.1.4 所用仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 农杆菌培养
• 0代种子的收获'>5.2.2 农杆菌菌株对拟南芥的侵染和T₀代种子的收获
• 5.2.3 转基因拟南芥纯合子的筛选
• 5.2.4 转基因植株的分子检测
• 5.2.5 转基因植株的表达检测
• 5.2.6 GhERF对下游防卫基因的表达调控检测
• 5.2.7 转基因拟南芥植株对毒素处理的抗性鉴定
• 5.3 结果与分析
• 0代种子的获得'>5.3.1 转基因拟南芥T₀代种子的获得
• 5.3.2 纯合子的获得
• 5.3.3 GhERF转基因拟南芥植株基因组水平的检测
• 5.3.4 GhERF转基因拟南芥植株表达水平的检测
• 5.3.5 GhERF对下游防卫基因的表达调控检测
• 5.3.6 GhERF转基因拟南芥植株的抗性鉴定
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 6.1 主要结论
• 6.2 后续工作
• 参考文献
• 附录 所用培养基、母液和缓冲液配制方法
• 致谢
• 作者简历