论文摘要
背景与目的糖尿病及其并发症给患者本人和家庭带来了极大的病痛和经济负担，也给社会带来巨大的压力。1型糖尿病和后期的2型糖尿病必须补充胰岛素，而外源性胰岛素替代治疗易产生血糖波动，会发生低血糖等严重并发症，依从性的差异也影响其疗效。重建体内胰岛素分泌系统，是理想的根治性方法。成体器官的干细胞可以作为胚胎干细胞的另一选择分化成为胰岛素生成细胞，而且避免了免疫排斥这个难题。肝脏和胰腺从内胚层同一细胞群发育而来，具有相同的祖细胞，因此我们认为肝脏成体干细胞可能在一定条件下转化成胰腺的胰岛素分泌细胞。以下的实验研究是试图寻求合适的模型，以简单的方法得到量和质均相对较好的肝脏卵圆细胞，这是进行肝脏卵圆细胞分化胰岛素分泌细胞等后续研究的基础。材料和方法Sprague-Dawley（SD）大鼠分为4组包括空白对照组（control）、2-乙酰氨基芴（2-AAF）组、2-AAF／四氯化碳（CCl4）组和2-AAF／肝切组（2-AAF／PH）。Control组在整个饲养过程中每天灌胃玉米油，剂量4ml／kg。2-AAF组在整个饲养过程中每天灌胃20mg／kg的2-AAF（溶于玉米油中，浓度0.5％）。2-AAF／PH组先灌胃20mg／kg的2-AAF（溶于玉米油中，浓度0.5％）5天，第6天大鼠在戊巴比妥（0.1ml／100g大鼠体重）腹腔注射下进行肝大部切除手术，当天不灌胃2-AAF，术后第1天再开始灌胃20mg／kg的2-AAF。2-AAF／CCl4组先灌胃20mg／kg的2-AAF（溶于玉米油中，浓度0.5％）7天，第8天腹腔注射1.9ml／kg CCl4（1：1体积溶于玉米油中），术后第1天再开始灌胃20mg／kg的2-AAF。时间点从肝大部切除术后和CCl4腹腔注射后开始算起。糖尿病模型由SD大鼠腹腔注射含STZ 60mg／kg 0.1M pH4.5枸橼酸钠液，3天后测血糖高于16.67mmol／L，表示模型建立成功。肝切和CCl4注射后第13天，大鼠在戊巴比妥钠（0.1ml／100mg大鼠体重）腹腔注射下全麻，行Seglen的二步胶原酶原位灌注消化法，结合密度梯度离心、流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术（异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠Thy1.1抗体）分离肝脏卵圆细胞，细胞在含10％胎牛血清、10mg／ml白血病抑制因子（LIF）、10ng／ml巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、10ng／ml干细胞因子（SCF）、10ng／ml白介素3（IL-3）、10ng／ml白介素6（IL-6）的DMEM／F12培养基中培养。结果通过流式细胞仪对肝细胞悬液Thy1.1阳性细胞的分选，结果发现不同的大鼠模型存在不同Thy1.1（+）细胞比例。从大到小分别是2-AAF（0.5％），2-AAF／PH（0.3％），2-AAF／CCl4（0.3％），diabetic model（0.1％）和control（0.0％）。新鲜分离纯化的细胞呈单个游离状态，培养12 h后开始贴壁，至48～72 h后大部分细胞贴壁，贴壁细胞呈梭型或多角型，呈现上皮细胞的特点；1周后细胞呈逐渐聚集趋势，3～4周后可见克隆样增殖结构形成，由大小不一、圆形或椭圆形细胞聚集在一起。结论2-AAF组、2-AAF／CCl4组和2-AAF／PH是均是较理想的卵圆细胞增殖模型。胶原酶消化法与Percoll密度梯度离心及流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术能有效地分离肝脏卵圆细胞，是分离成体肝脏卵圆细胞有效的方法。胰岛组织损伤可能刺激具有干细胞的组织，使肝脏卵圆细胞等发生增殖。这一发现对将来肝脏卵圆细胞分化为胰岛素分泌细胞的应用有一定的意义。