水稻纹枯病菌（Rhizoctorzia solani）转化体系的建立

论文摘要

由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani K（?）hn）引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一,几乎没有稻田不发生纹枯病,全世界平均每年因该病造成的损失达数十亿公斤稻谷。但目前为止人们对该病的致病机理了解不多,还未发现相应的抗病基因和对此病免疫或高抗的水稻品种,发现的中抗以上的品种也寥寥无几,因而只能任其肆虐。为从分子水平上揭示立枯丝核菌的致病机理,本研究参照稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）原生质体遗传转化体系建立起了立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系,并进一步将组蛋白增强型绿色荧光蛋白（Histon enhanced green fluorescentprotein,eGFP）成功表达于纹枯菌。本研究首先使用裂解酶（源自木黴菌,Trichoderma harzianum）和0.8M Nacl（pH5.8,作为渗透压稳定剂）处理纹枯菌菌丝,成功分离出了其原生质体。随后通过实验确定了纹枯菌原生质体在固体TB3培养基上的再生条件及-80℃低温冻存条件。接着参照稻瘟菌原生质体的遗传转化体系,建立了纹枯菌的原生质体遗传转化体系。通过PCR验证和测序验证,证实外源的潮霉素抗性基因已整合到转化子后代中。构建了针对纹枯菌和稻瘟菌的组蛋白增强型绿色荧光蛋白（Histon enhancedgreen fluorescent protein,eGFP）载体。首先根据基因库中稻瘟菌的组蛋白H3序列（GeneBank登录号为gi 39973389）设计引物,应用PCR方法获得了稻瘟菌和纹枯菌中可能的组蛋白H3基因组序列和编码序列。经blastp（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）分析,显示该序列所编码的蛋白质为组蛋白H3。接着将其连接到绿色荧光蛋白（GFP,green fluorescent protein）的C末端,组成了GFP-H3融合蛋白,并进一步将其接入pSM565载体,构建成eGFP载体。荧光显微镜观察结果表明,携带该载体的转化子能发出绿色荧光。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 水稻纹枯病概况
• 1.1.1 水稻纹枯病简介
• 1.1.2 水稻纹枯病的危害
• 1.1.3 纹枯菌侵染水稻的过程
• 1.1.4 纹枯菌侵染水稻的特点
• 1.1.5 纹枯菌的致病机理
• 1.2 丝状真菌遗传转化系统简介
• 1.2.1 丝状真菌原生质体的制备
• 1.2.2 针对丝状真菌原生质体的转化方法
• 1.2.2.1 PEG介导转化法
• 1.2.2.2 电击转化法
• 1.2.2.3 限制性内切酶介导转化法
• 1.2.3 针对丝状真菌完整细胞的转化方法
• 1.2.3.1 醋酸锂转化法
• 1.2.3.2 基因枪转化法
• 1.2.3.3 根癌农杆菌介导转化法
• 1.2.4 用于丝状真菌原生质体转化系统的载体
• 1.2.5 用于丝状真菌遗传转化系统的选择标记
• 1.2.5.1 营养缺陷型标记
• 1.2.5.2 药物抗性标记
• 1.2.5.3 功能标记
• 1.3 增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）简介
• 1.3.1 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）
• 1.3.2 组蛋白增强型绿色荧光蛋白（Histon enhanced green fluorescent protein）
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 所用纹枯菌（Rhizoctorzia solani）和稻瘟菌（Magnaporthe grisea）
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 大肠杆菌菌种
• 2.1.4 主要试剂、酶类和试剂盒
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 稻瘟菌（Magnaporthe grisea）原生质体转化
• 2.2.1.1 稻瘟菌原生质体的制备
• 2.2.1.2 稻瘟菌原生质体转化
• 2.2.2 水稻纹枯菌（Rhizoctorzia solani）原生质体转化
• 2.2.2.1 水稻纹枯菌原生质体的制备
• 2.2.2.2 水稻纹枯菌原生质体的再生
• 2.2.2.3 水稻纹枯菌原生质体的转化
• 2.2.3 水稻纹枯菌基因组DNA的大量提取
• 2.2.4 纹枯菌转化子的培养及其DNA的小量制备
• 2.2.5 转化子的PCR验证
• 2.2.6 转化子的测序验证
• 2.2.6.1 从琼脂糖凝胶中回收目的片段
• 2.2.6.2 目的片段的克隆
• 2.2.6.3 质粒DNA的小量制备与纯化
• 2.2.6.4 测序反应
• 2.2.7 稻瘟菌和纹枯菌中Histon的克隆
• 2.2.8 Histone-enhanced green fluorescent protein（eGFP）载体的构建
• 2.2.8.1 载体中Histone组件的克隆
• 2.2.8.2 PCR产物纯化
• 2.2.8.3 在纯化后的PCR产物上加A尾
• 2.2.8.4 载体构建
• 2.2.9 GFP和eGFP短暂表达及观察
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻纹枯菌（Rhizoctonia solani）原生质体的制备
• 3.1.1 水稻纹枯菌原生质体的分离
• 3.1.2 水稻纹枯菌原生质体的收集
• 3.1.3 水稻纹枯菌原生质体的再生
• 3.1.4 水稻纹枯菌原生质体的保存
• 3.2 水稻纹枯菌原生质体遗传转化体系的建立
• 3.2.1 固体培养基中用于转化子筛选的潮霉素（hygromycin）浓度的确定
• 3.2.2 液体培养基中用于转化子筛选的潮霉素（hygromycin）浓度的确定
• 3.2.3 转化子的PCR验证
• 3.2.4 转化子的测序验证
• 3.3 水稻纹枯菌中的histon H3（组蛋白H3）基因的克隆
• 3.4 稻瘟菌和水稻纹枯菌eGFP载体的构建
• 3.4.1 T载体的构建
• 3.4.2 稻瘟菌和水稻纹枯菌H3-GFP和GFP-H3融和蛋白表达中间载体的构建
• 3.4.3 稻瘟菌和水稻纹枯菌GFP-H3载体的构建
• 3.5 GFP载体的构建
• 3.6 水稻纹枯菌和稻瘟菌中的GFP和GFP-H3载体的短暂表达及观察
• 4 讨论
• 4.1 水稻纹枯菌（Rhizoctonia solani）原生质体的制备
• 4.2 水稻纹枯菌（Rhizoctonia solani）原生质体遗传转化
• 4.3 T载体的构建
• 5 参考文献
• 6 附录:所用培养基和试剂配方
• 致谢