论文摘要
第一部分化学合成siRNA抑制大鼠血管平滑肌细胞TF基因表达目的探讨siRNA对大鼠血管平滑肌细胞组织因子基因沉默作用的可行性和有效性。方法设计并合成针对大鼠组织因子的25bp双链siRNA分子。使用组织因子siRNA、对照siRNA转染大鼠血管平滑肌细胞,同时设立空白对照组。荧光显微镜观察转染效率。PDGF-BB刺激血管平滑肌细胞后RT-PCR检测组织因子mRNA表达,免疫印迹和免疫组化检测组织因子蛋白表达。结果siRNA成功转染到血管平滑肌细胞,转染效率约90±2.3%。三对候选siRNA筛选出基因抑制效率最高一对,与未转染组相比,转染24h组织因子mRNA表达减少86±0.6%,转染48h组织因子蛋白表达减少92±1.0%,同时免疫组化检测TF表达明显减弱。结论RNA干扰能明显下调大鼠血管平滑肌细胞组织因子表达。第二部分组织因子siRNA壳聚糖纳米粒的制备及其特性目的探讨壳聚糖-组织因子小干扰RNA（TFsiRNA）纳米粒制备方法及其特征,并观察体外基因沉默作用。方法采用三聚磷酸钠（TPP）离子胶凝法制备壳聚糖-siRNA纳米粒。检测纳米粒平均粒径和zeta电位、载药率、体外控释效果,并分析血清稳定性、体外生物活性及其细胞毒性。结果两种纳米粒平均粒径小于400nm,粒径大小主要取决于壳聚糖分子量及其浓度。壳聚糖与TPP质量比、酸碱度也影响粒径大小。包封型纳米粒siRNA载药率为100%。高分子量壳聚糖纳米粒控释效果好。壳聚糖-TPP-TFsiRNA纳米粒中的siRNA在5%血清孵育24h开始降解,60h完全降解;50%血清孵育6h保持完整,48h完全降解。CS-TPP-TFsiRNA纳米粒基因沉默作用可与Lipofectamine2000相比:包封型79±1.5%,吸附型62±5.9%。结论壳聚糖纳米粒是一种安全有效siRNA转运载体。第三部分大鼠静脉移植物组织因子表达及其意义目的检测静脉移植物管壁组织因子表达变化及其意义。方法建立SD大鼠同侧颈外静脉-颈总动脉移植模型,分别于术后1、3、7、14、28天取材。对侧颈外静脉作为对照。免疫组化观察管壁组织因子、增殖细胞核抗原表达,同时检测标本蛋白抽提物组织因子凝血活性。使用计算机图像分析系统分析内膜、中膜厚度。结果所有移植物血管外膜均有组织因子表达,早期移植物（术后1、3、7天）内膜、中膜组织因子表达明显增加,晚期移植物（术后14、28天）内膜、中膜无组织因子表达;对侧对照静脉内膜、中膜无组织因子表达。术后3天可以观察到PCNA蛋白阳性表达,7天明显增高,14天达到最高。对照组静脉、早期和晚期静脉移植物血管蛋白抽提物TF活性分别为0.28±0.02、0.29±0.04、0.28±0.04 （U/mg）,差异无统计学意义（P>0.05）。移植物内膜在术后7、14、28天增生明显,而中膜在术后14、28天增生明显。结论不同时间点静脉移植物管壁组织因子表达发生变化并与新内膜增生相关。第四部分Atelocollagen介导siRNA局部作用抑制大鼠静脉移植物内膜增生目的评价局部应用组织因子siRNA抑制静脉移植物内膜增生效果。方法建立SD大鼠颈静脉-颈总动脉移植模型。使用Atelocollagen-siRNA混合物涂抹于静脉移植物周围,检测管壁BLOCK-iTTM荧光寡核苷酸确认其稳定性和转染效率。免疫印迹和免疫组化检测管壁TF蛋白表达,同时检测管壁细胞增殖指数,计算术后28天新生内膜厚度。结果静脉移植物可观察到BLOCK-iTTM绿色荧光并持续到术后7天。治疗组使用Atelocollagen携带siRNA有效抑制管壁TF蛋白表达,细胞增殖指数减少,术后28天新生内膜厚度减少68±3.2%。结论非病毒载体Atelocollagen携带siRNA有效下调静脉移植物TF表达抑制内膜增生,这为静脉移植物狭窄基因治疗提供新的有效工具。第五部分静电纺丝血管外支架缓释siRNA纳米粒抑制静脉移植物内膜增生目的评价PLGA/CS纳米粒杂化超细纤维膜血管外支架缓释组织因子小干扰RNA抑制静脉移植物内膜增生的有效性。方法使用改进静电纺丝技术制备PLGA/CS纳米粒杂化超细纤维膜。氯仿溶解杂化膜PLGA后测量壳聚糖含量,检测超细纤维膜吸水率。建立SD大鼠右颈外静脉-颈总动脉间置移植模型,随机分为5组:A组（PLGA/CS-TFsiRNA纳米粒外支架组）,B组（PLGA/CS-StealthTM RNAi阴性对照纳米粒外支架组）,C组（PLGA/CS空白纳米粒外支架组）,D组（PLGA外支架组）,E组（无外支架组）。BLOCK-iTTM荧光寡核苷酸检测静脉移植物转染。分别于术后1,3,7,14,28天取标本。免疫印迹和免疫组化检测管壁组织因子蛋白表达,免疫组化检测管壁增殖细胞核抗原表达,计算机图像系统分析新生内膜厚度。结果通过调节静电纺丝PLGA和壳聚糖纳米粒溶液流量控制杂化膜中PLGA和壳聚糖含量。杂化膜由于加入壳聚糖具有良好吸水性。术后12天静脉移植物管壁可检测BLOCK-iTTM荧光寡核苷酸绿色荧光。术后3、7天A组组织因子蛋白表达明显低于其他组（P<0.05）,术后14天A组增殖细胞核抗原表达明显低于其他组（P<0.01）,A组术后28天新生内膜厚度明显低于未治疗组（P<0.01）。结论静电纺丝制备PLGA/CS纳米粒杂化超细纤维膜血管外支架缓释组织因子siRNA能有效抑制大鼠静脉移植物早期内膜增生,这将成为基因治疗静脉移植物狭窄一种新方法和手段。
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