L-丝氨酸高产菌株的选育及基因工程菌的构建

论文摘要

L-丝氨酸在医药、食品、化妆品等行业具有广泛的应用,但由于高昂的价格限制了它的使用,我国大部分产品主要依赖进口。目前,主要采用化学合成的方法生产L-丝氨酸,但生成的产物属DL-型,拆分困难,且生产过程对环境造成的污染严重,而微生物发酵法生产L-丝氨酸以其低成本,低污染,产品纯度高等优点倍受人们的关注,然而高产量的微生物菌株的选育是发酵法生产L-丝氨酸的前提和关键。本实验主要是采用化学诱变的方法,以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）C-11为出发菌株,筛选出L-丝氨酸反馈抑制脱敏和L-丝氨酸分解能力缺失的突变株,在此基础上,通过摇瓶发酵实验进一步筛选高产的L-丝氨酸生产菌株,得到的突变株的L-丝氨酸产量由原始菌株的10g/L增至18g/L。然后,以突变株的染色体DNA为模板克隆到菌株代谢产生L-丝氨酸途径中的关键酶的基因:D-3-磷酸甘油酸脱氢酶（D-3-phosophoglycerate dehydrogenase,D-3-PGDH）的基因（serA）,再以穿梭质粒pEC7为克隆和表达载体,构建重组质粒并转化该突变株,得到数株具有多拷贝D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因的基因工程菌株,经摇瓶发酵实验筛选出具有高表达量的目标菌株2株,它们的L-丝氨酸的平均产量为28g/L,在原始菌株的基础上有明显的提高。L-丝氨酸高产突变株的获得和基因工程菌株的成功构建,将降低L-丝氨酸的价格,扩大它在各领域的广泛应用,为直接发酵法生产L-丝氨酸的产业化奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 L－丝氨酸简介
• 1.2 L－丝氨酸的用途
• 1.3 L－丝氨酸的制备方法
• 1.3.1 蛋白质水解法
• 1.3.2 化学合成法
• 1.3.3 酶法
• 1.3.4 发酵法
• 1.4 国内外L－丝氨酸生产概况
• 1.5 论文研究意义、设计思路与主要研究内容
• 1.5.1 论文研究意义
• 1.5.2 论文设计思路与主要研究内容
• 第二章 L－丝氨酸高产突变菌株的选育
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 L－丝氨酸标准曲线
• 2.2.2 L－丝氨酸分解活性缺失突变株的获得
• 2.2.3 L－丝氨酸反馈抑制脱敏的突变株的获得
• 2.2.4 突变株的遗传稳定性
• 2.2.5 实验分析
• 第三章 L－丝氨酸高产基因工程菌的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 染色体DNA 的检测
• 3.2.2 Ser A 基因扩增
• 3.2.3 重组质粒的构建
• 3.2.4 JM109 的转化与转化子的获得
• 3.2.5 宿主菌的转化
• 3.2.6 工程菌L－丝氨酸产量的测定
• 3.2.7 实验分析
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 附表 1 仪器与设备
• 附表 2 溶液与试剂
• 附表 3 工具酶与分子生物学试剂（盒）
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 发表的相关文章与申请的专利