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多浆旱生植物霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及表达分析

2020-12-07阅读(1020)

多浆旱生植物霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及表达分析

论文摘要

盐胁迫是影响作物生长和产量的主要非生物因素之一。土壤中过高的Na+浓度引起离子毒害、渗透胁迫和K+/Na+比率失调使植物新陈代谢紊乱,从而对植物造成伤害。植物抵御盐胁迫的有效策略之一是通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白将细胞质中过多的Na+区域化在液泡内,以减轻过量Na+对细胞质的伤害,同时维持细胞的渗透势,从而提高植物的耐盐抗旱性。从极端干旱环境中生存的荒漠植物中克隆和鉴定液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,对农作物和优良牧草耐盐抗旱性的遗传改良具有重要意义。本研究以多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）为实验材料,克隆到液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX和Actin片段,并以Actin为内参对ZxNHX在盐处理下的表达进行了研究。主要结果如下:1.根据已知的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE方法,从霸王中克隆到液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的全长cDNA,将其命名为ZxNHX。该cDNA全长2127bp,包括1599bp的开放阅读框（ORF）、213 bp的5’非翻译区（5’UTR）、315 bp的3’非翻译区（3’UTR）和25 bp的poly（A）尾巴。此cDNA编码一个532个氨基酸的多肽,推测分子量为58.8 KDa,等电点为7.23。霸王ZxNHX的氨基酸序列与已报道的胡杨PeNHX2、拟南芥AtNHX1、毛白杨PtNHX1、北滨藜AgNHX1、盐地碱蓬SsNHX1和水稻OsNHX1的同源性较高,分别为81%、80%、79%、78%、74%和73%。ZxNHX蛋白含有12个跨膜区,其中TM3具有高度保守的氨氯吡嗪脒结合位点(78LFFYLLPPI87)。此外,ZxNHX含有2个糖基化位点,分别为Asn44、Asn287,表明此蛋白是已糖基化的蛋白。ZxNHX已在GenBank注册,登录号为EU103624。2.根据已知的Actin基因的保守区设计简并性引物,利用RT-PCR方法从霸王中克隆到Actin基因片段,将其命名为ZxACT。该片段大小为598 bp,编码198个氨基酸。序列分析表明,ZxACT与其他植物的Actin基因核苷酸序列的同源性在82%以上;而与氨基酸序列的同源性达91%以上。ZxACT已在GenBank注册,登录号为EU019550。3.半定量RT-PCR分析结果显示,ZxNHX在叶和根中均表达,但叶中的表达量明显高于根;在高浓度盐处理下(150、200 mmol·L-1NaCl),ZxNHX转录水平明显上调,在处理3、12h后达到最大值。由此表明,ZxNHX表达受盐胁迫的诱导和调节。

论文目录

  • 缩写词表
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 第二章 国内外研究进展
  • +/H+逆向转运蛋白的发现'>1 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的发现
  • +/H+逆向转运蛋白的分子克隆'>2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子克隆
  • +/H+逆向转运蛋白的结构及其特性'>3 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的结构及其特性
  • +/H+逆向转运蛋白的主要功能'>4 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的主要功能
  • 4.1 液泡离子区域化功能
  • 4.2 调节液泡pH
  • 4.3 影响叶的发育
  • +/H+逆向转运蛋白的表达及其调控机制'>5 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的表达及其调控机制
  • +/H+逆向转运蛋白的表达特性'>5.1 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的表达特性
  • +/H+逆向转运蛋白表达的调控机制'>5.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白表达的调控机制
  • +/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性'>6 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性
  • +/H+逆向转运蛋白的活性'>6.1 盐胁迫下液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的活性
  • +/H+逆向转运蛋白基因的过量表达增强植物的耐盐性'>6.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的过量表达增强植物的耐盐性
  • 第三章 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 菌株和质粒
  • 1.3 主要试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 霸王总RNA的提取
  • +/H+逆向转运蛋白基因核心片段的克隆'>2.2 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因核心片段的克隆
  • +/H+逆向转运蛋白基因3'端的克隆（3'-RACE）'>2.3 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因3'端的克隆（3'-RACE）
  • +/H+逆向转运蛋白基因5'端的克隆（5'-RACE）'>2.4 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因5'端的克隆（5'-RACE）
  • +/H+逆向转运蛋白基因的特性分析'>2.5 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的特性分析
  • 2.6 霸王Actin基因片段的克隆及序列分析
  • 2.7 盐处理下霸王ZxNHX的表达分析
  • 第四章 结果
  • 1 霸王总RNA的提取
  • 1.1 总RNA纯度和产量检测
  • 1.2 总RNA完整性检测
  • +/H+逆向转运蛋白基因核心片段的克隆'>2 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因核心片段的克隆
  • 2.1 简并性引物设计
  • 2.2 RT-PCR扩增
  • 2.3 阳性克隆的鉴定
  • 2.4 测序结果及序列分析
  • +/H+逆向转运蛋白基因3'端的克隆'>3 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因3'端的克隆
  • 3.1 3'-RACE扩增
  • 3.2 阳性克隆的鉴定
  • 3.3 测序结果及序列分析
  • +/H+逆向转运蛋白基因5'端的克隆'>4 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因5'端的克隆
  • 4.1 5'-RACE扩增
  • 4.2 阳性克隆的鉴定
  • 4.3 测序结果及序列分析
  • +/H+逆向转运蛋白基因的特性分析'>5 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的特性分析
  • +/H+逆向转运蛋白全长cDNA的特征'>5.1 霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白全长cDNA的特征
  • +/H+逆向转运蛋白的多重比较'>5.2 植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的多重比较
  • +/H+逆向转运蛋白的特征'>5.3 推测的霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的特征
  • 6 霸王Actin基因片段的克隆及序列分析
  • 6.1 RT-PCR扩增
  • 6.2 阳性克隆的鉴定
  • 6.3 测序结果及序列分析
  • 7 霸王ZxNHX的表达分析
  • 7.1 ZxNHX组织特异性表达
  • 7.2 低浓度盐处理下ZxNHX表达特性
  • 7.3 高浓度盐处理下ZxNHX表达特性
  • 第五章 讨论
  • 1 霸王总RNA的提取
  • 2 霸王ZxNHX的克隆及特性分析
  • 3 霸王Actin基因片段的克隆及序列分析
  • 4 RT-PCR半定量分析霸王ZxNHX的表达特性
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 在读期间发表的论文
  • 致谢

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