重组人肝再生增强因子的表达和活性研究

论文摘要

人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子，除促进肝细胞增殖外，还能保护肝脏，预防肝纤维化。本实验采用毕赤酵母表达系统，以分泌方式高效表达重组hALR（rhALR），通过色谱法分离纯化获得高纯度rhALR，并对rhALR的生物学活性进行了研究。设计引物从pBV220-hALR上扩增hALR基因片断，构建重组酵母表达质粒pPICZαA-hALR；经验证正确后，表达质粒pPICZαA-hALR线形化浓缩，转化P．pastoris GS115形成重组转化子；重组酵母菌经PCR鉴定、高浓度Zeocin抗性筛选得多拷贝子，经0.5％甲醇诱导培养后，在培养上清中发现rhALR；Western-blot分析表明，在酵母培养上清中rhALR以二聚体形式存在，分子量为30kD；扫描分析结果表明，酵母培养上清中rhALR占总蛋白的66％，总量约为100mg／L。酵母培养上清经70％饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐和低盐透析两种方法处理，用Sepharose DEAE Fast Flow柱和Sephadex G75柱两步纯化，可得纯度约为90％的rhALR，回收率约为26％。体外细胞活性实验表明，rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞增殖；在大鼠1／3肝切模型中，rhALR明显促进肝细胞再生，使有丝分裂指数（MI）、细胞增殖核抗原（PCNA）增多；在大鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤模型中，100μg／L rhALR能提高D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠的存活率。通过上述实验，成功构建了人肝再生增强因子重组毕赤酵母表达菌，并获得高纯度有活性的rhALR。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现
• 1.2 人肝再生增强因子（hALR）的克隆
• 1.3 hALR的基因结构
• 1.4 hALR的组织表达定位和受体的确定
• 1.5 hALR的生物学活性
• 1.6 hALR的作用机制
• 1.7 本研究的意义和主要内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 试验动物与细胞株
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 克隆载体的构建
• 2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.3 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达
• 2.2.4 rhALR的纯化
• 2.2.5 rhALR活性检测
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 重组载体pPICZaA-hALR构建结果
• 3.1.1 hALR的PCR扩增结果
• 3.1.2 克隆载体pMD-18T-hALR的菌落PCR和酶切鉴定结果
• 3.1.3 表达载体pPICZaA-hALR菌落PCR和酶切鉴定结果
• 3.1.4 DNA测序结果
• 3.2 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达
• 3.2.1 pPICZaA-hALR电穿孔法转化毕赤酵母GS115
• 3.2.2 pPICZaA-hALR原生质球法转化毕赤酵母GS115
• 3.2.3 酵母工程菌基因组DNA的提取与PCR检测
• 3.2.4 酵母工程菌pPICZaA-hALR/GS115的表型鉴定
• 3.2.5 转化菌株诱导表达筛选检测
• 3.2.6 重组酵母表达上清的Westernblot分析
• 3.2.7 高表达工程菌rhALR最佳表达时间的确定
• 3.3 rhALR的纯化
• 4）₂SO₄沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清'>3.3.1 （NH₄）₂SO₄沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清
• 3.3.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化rhALR
• 3.3.3 SephadexG-75凝胶层析精制rhALR
• 3.4 rhALR活性实验结果
• 3.4.1 rhALR体外促进细胞增殖的活性
• 3.4.2 rhALR促进1/3肝切除大鼠肝细胞增殖
• 3.4.3 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠存活率的影响
• 3.4.4 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠肝细胞修复作用
• 第四章 讨论
• 一、hALR在毕赤酵母中的分泌表达
• 二、rhALR的纯化
• 三、rhALR的活性研究
• 第五章 总结
• 一、本论文的结果
• 二、论文的进一步研究设想
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢