丁基苯酞对鱼藤酮帕金森病模型保护作用的实验研究

论文摘要

目的:探讨丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide, NBP）对鱼藤酮诱导的帕金森病细胞和动物模型的保护作用及其可能的机制。方法:（1）细胞实验:分别使用终浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM NBP和溶剂二甲基亚砜（DMSO）预处理SH-SY5Y细胞24 h后,加入终浓度为200 nM的鱼藤酮处理24 h建立多巴胺能细胞损伤模型。观察细胞形态学变化,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞活性,荧光显微镜下观察细胞凋亡与坏死（Hoechst33342/PI）,流式细胞术检测细胞凋亡率（Annexin V-FITC/PI）、线粒体膜电位（JC-1）、细胞内活性氧水平（DCFH-DA）;（2）动物实验:Sprague-Dawley大鼠单侧黑质致密部（SNc）和中脑腹侧被盖区（VTA）两点立体定向注射鱼藤酮制备帕金森病大鼠模型,随机分组后,治疗组采用NBP 80mg/kg/d连续灌胃给药14 d。计数30 min内阿扑吗啡（APO）诱发的旋转圈数;分光光度计测定中脑丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力;免疫组织化学染色测定黑质酪氨酸羟化酶（TH）及神经细胞核（NeuN）双重阳性细胞数量;（3）机制研究:在人神经母细胞瘤多巴胺能的四种不同细胞系（SH-SY5Y细胞株、IMR-32细胞株、SK-N-AS细胞株及BE（2）-M17细胞株）中,100μM NBP和DMSO分别加入上述培养的四种细胞系中作用24 h,免疫荧光染色测定α-突触核蛋白（SNCA）表达,实时荧光定量PCR检测SNCA以及囊泡单胺转运体（VMAT2） mRNA表达;在动物实验中,随机分组后,各组分别在处死前18 h和6 h腹腔注射NBP（80 mg/kg,NBP:DMSO:PBS = 1:2:17）或溶剂（DMSO:H2O = 3:17）,免疫荧光染色测定VMAT2或SNCA表达,实时荧光定量PCR检测SNCA以及VMAT2 mRNA表达。结果:200 nM鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h能够诱导细胞活性下降和细胞凋亡。NBP预处理后,SH-SY5Y细胞存活率显著升高,细胞凋亡率明显降低,线粒体膜电位显著升高（P<0.05）,细胞内活性氧水平明显降低（P<0.05）,在一定浓度范围内,随着NBP浓度的增加对SH-SY5Y细胞的保护作用增强。使用NBP治疗鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型两周,可明显改善PD大鼠旋转行为（降低48%,与鱼藤酮组相比,P<0.05）,提高黑质DA神经元的存活率（增加30%,与鱼藤酮组相比,P<0.05）以及纹状体DA神经元的数目（增加49%,与鱼藤酮组相比,P<0.05）。另外,在大鼠黑质致密部及四种细胞系中,NBP组与溶剂对照组相比,SNCA蛋白的表达量无显著性差异（P>0.05）,VMAT2蛋白表达量增加了63.76%;实时荧光定量RT-PCR结果显示,与溶剂对照组相比,NBP组在SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞中VMAT2 mRNA表达量分别增加了16.32%、39.39%;而在SK-N-AS细胞及BE（2）-M17细胞中NBP对VMAT2 mRNA表达并无明显影响。与溶剂对照组相比,NBP组在大鼠中脑黑质致密部中VMAT2 mRNA表达量上调了38.35%（以GAPDH作内参）和80.76%（以β-actin作内参）,而SNCA mRNA表达无明显统计学差异。结论:NBP可明显缓解鱼藤酮在PD细胞模型和动物模型中诱导的损伤,可能通过抑制细胞发生凋亡、线粒体保护、抗自由基损伤、上调PD保护性基因VMAT2表达等机制实现,研究还发现NBP并不引起SNCA过表达,充分体现其无诱发蛋白聚集的潜能,表明NBP是一个很有潜力的用于PD治疗的神经保护药物。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一节 NBP 对帕金森病细胞模型保护作用的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 第二节 NBP 对帕金森病动物模型保护作用的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 第三节 NBP 对帕金森病模型保护作用机制的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 附录1
• 附录2
• 致谢