铜尾矿不同氧化层中微生物多样性研究

论文摘要

矿业废弃地是一种典型的人为裸地,具有极端严酷的基质条件。微生物是生态系统功能群的重要组成部分。本文以铜尾矿不同氧化状态四种表层样品（白色盐结晶Y1层、淡黄色盐结晶Y2层、黄褐色盐结晶Y3层、深褐色盐结晶Y4层）和铜尾矿铜富集区垂直方向四种不同深度层次样品（AO层0-2cm、A层2-10cm、B层10-20cm、C层20-30cm）为研究对象,利用rRNA作为分子标记,采用构建16S rDNA克隆文库、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析以及克隆测序的方法,研究铜陵铜尾矿废弃地中细菌群落多样性组成和结构变化情况,同时利用统计学方法分析环境因子对细菌多样性及群落组成的影响。结果表明：（1）铜尾矿不同氧化状态表层样品的理化性质差异不明显,四种表层样品均具有较低的pH,在2.50至3.11之间,是典型的极端酸性环境。Cu、Fe、Zn、Cr、Pb五种重金属总量在Y3、Y4层的含量显著高于Y1、Y2层。四种样品所包含的矿物种类主要均为石膏,石膏在Y1、Y2层的含量超过99%。Y3、Y4层除含有较高比例的石膏外,还检测到石英、蒙脱石等矿物的存在。通过建立四种不同表层样品的细菌16S rDNA克隆文库,并利用RFLP分析及测序、比对、构建系统发育树,发现在这四种表层样品中均以Betaproteobacteria为绝对优势类群；其次各层均检测到Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria两个类群的存在；除Y1层以外,在其他三层均检测到少量Bacteroidetes类群,在Y2、Y3层检测到少量Cyanobacteria类群,在Y1、Y2层检测到少量Firmicutes类群,而仅在Y4层检测到少量Actinobacteria类群存在。（2）铜富集区垂直方向不同深度层次的四种样品理化性质差异显著,pH（r=0.980,P=0.000<0.01）、总磷（r=0.962,P=0.000<0.01）与深度具有极显著的正相关性；含水量（r=-0.816,P=0.001<0.01）、总氮（r=-0.780,P=0.003<0.01）与深度具有极显著的负相关性。各层样品重金属总量差异显著,AO层要明显低于其下三层；Cu、Zn、Pb总量均在B层出现最大值；Fe和Cr随深度的增加表现为先降低后升高的趋势。各层样品的矿物组成及数量分布也明显不同,AO、A层矿物种类较少,主要矿物为石膏,均在97%以上。B、C层矿物种类较多,包含有石膏、石英、长石、绿泥石、石榴石、角闪石、蒙脱石、伊利石、方解石,其中以石英含量最高。通过建立四种不同深度层次样品的细菌16S rDNA克隆文库,并利用RFLP分析及测序分析发现：除A层以Cyanobacteria为主要优势类群,其余三层均以Betaproteobacteria为主要优势类群；Gammaproteobacteria类群在各层均有分布,且随深度的增加其数量分布比例逐渐减小；Alphaproteobacteria类群仅在AO、B两层中被检测到有少量存在,而Firmicutes类群仅在AO、A两层中被检测到有少量存在；另外仅在A层检测到少量Bacteroidetes、Planctomycetes类群存在。（3）环境因子对细菌多样性及其群落结构组成的影响比较复杂。本文运用典型相关分析（CCA）发现,环境因子中的总氮、含水量、pH、铁总量对不同氧化层中微生物的群落组成可能产生主要影响。蒙特卡洛测验（Monie-Carlo test）的结果显示样品中多数环境因子不能独立用于微生物群落组成的解释。运用主成分分析（PCA）从整体角度阐明了环境因子的综合作用可能控制了微生物群落的分布。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 铜陵铜尾矿的环境特征
• 1.1.1 铜尾矿的形成及化学性质
• 1.1.2 铜尾矿的氧化过程
• 1.1.3 铜尾矿中铜的迁移富集
• 1.2 两种极端环境微生物的研究概况
• 1.2.1 强酸环境中的微生物
• 1.2.2 寡营养环境中的微生物
• 1.3 微生物多样性的概念及研究方法
• 1.3.1 微生物多样性概念及意义
• 1.3.2 微生物多样性的分子生态学研究方法
• 1.3.3 16S rDNA克隆文库构建和RFLP分析
• 1.4 本研究的内容、技术路线与目的意义
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 研究内容和技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 铜尾矿不同氧化层样品的采集与保存
• 2.2 样品的理化性质分析
• 2.2.1 pH和电导率的测定
• 2.2.2 含水量测定—烘干法
• 2.2.3 总有机质—灼烧法
• 2.2.4 总氮（TN）—高氯酸-硫酸消化蒸馏滴定法
• 2.2.5 总磷（TP）—硫酸-高氯酸消化钼锑抗比色法
• 2.3 ICP-AES法原理及样品重金属含量测定
• 2.3.1 ICP-AES法原理和优点
• 2.3.2 重金属总量测定前的样品预处理
• 2.4 XRD定量分析方法及样品矿物组成测定
• 2.5 铜尾矿不同氧化层微生物群落多样性分析
• 2.5.1 微生物基因组总DNA的提取
• 2.5.2 16S rRNA基因的PCR扩增
• 2.5.3 细菌16S rDNA克隆文库的构建
• 2.5.4 RFLP分析
• 2.5.5 序列测定及其系统发育分析方法
• 2.5.6 群落结构计算方法
• 2.5.7 从GenBank获取核酸序列登录号
• 2.6 统计学分析方法
• 第三章 不同氧化层铜尾矿理化性质分析
• 3.1 材料与方法
• 3.2 不同氧化层样品理化性质测定
• 3.2.1 不同氧化层样品理化性质的测定结果与分析
• 3.2.2 不同氧化层样品重金属含量的测定结果与分析
• 3.2.3 不同氧化层样品矿物学组成的测定结果与分析
• 3.2.4 环境因子的统计学分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 铜尾矿不同氧化层重金属含量与理化性质的关系
• 3.3.2 铜尾矿不同氧化层重金属含量与矿物组成的关系
• 第四章 铜尾矿不同氧化层度表层样品中微生物群落多样性分析
• 4.1 材料和方法
• 4.2 铜尾矿不同氧化层度表层样品微生物群落多样性分析
• 4.2.1 微生物基因组总DNA的提取结果
• 4.2.2 16S rRNA基因的PCR扩增结果
• 4.2.3 不同氧化程度表层样品细菌16S rDNA克隆文库构建
• 4.2.4 RFLP分析结果
• 4.2.5 不同氧化程度表层样品细菌群落结构的计算结果
• 4.2.6 序列系统发育分析
• 4.2.7 已获得的核酸序列登录号
• 4.2.8 不同表层微生物群落的聚类分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 16S rDNA文库在分析尾矿微生物多样性中的应用
• 4.3.2 铜尾矿不同表层微生物多样性差异分析
• 4.3.3 铜尾矿表层微生物群落组成分析
• 第五章 铜尾矿铜富集区不同层次微生物群落多样性分析
• 5.1 材料和方法
• 5.2 铜尾矿铜富集区不同层次微生物群落多样性分析
• 5.2.1 微生物基因组总DNA的提取结果
• 5.2.2 16S rRNA基因的PCR扩增结果
• 5.2.3 构建不同氧化层样品细菌16S rDNA克隆文库
• 5.2.4 RFLP分析结果
• 5.2.5 铜富集区不同层次细菌群落结构的计算结果
• 5.2.6 序列系统发育分析
• 5.2.7 已获得的核酸序列登录号
• 5.2.8 铜富集区不同垂直深度层次微生物群落的聚类分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 铜富集区不同垂直深度层次微生物多样性差异分析
• 5.3.2 铜富集区不同垂直深度层次微生物群落组成分析
• 第六章 环境因子对微生物群落结构的影响
• 6.1 典型相关分析（CCA）
• 6.2 主成分分析（PCA）
• 第七章 结论
• 第八章 存在问题与展望
• 1 存在的问题
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 附录