产酸性蛋白酶微生物的筛选及其在玉米淀粉生产中的应用

论文摘要

国内外玉米淀粉生产主要采用湿法加工工艺,传统湿法加工工艺中的浸泡条件是在含有0.2 %～0.25 % SO2的50℃±2℃的浸泡水中浸泡48 h,由于浸泡环节影响着后续各道工序的正常进行,并直接影响着淀粉的得率和品质,因此湿法加工工艺中的玉米浸泡环节是淀粉生产中的重要工序。然而,由于浸泡时间过长和使用SO2污染问题,造成能源浪费和无法实现绿色生产,已成为限制整个淀粉生产产业发展的瓶颈。采用SO2浸泡的目的,是利用亚硫酸打断包裹淀粉颗粒的蛋白质的二硫键,使得蛋白质分子结构松散,从而使淀粉颗粒游离出来,同时亚硫酸还具有防腐和杀灭杂菌的作用。本文基于SO2在浸泡水中所发挥的作用,筛选适宜玉米浸泡环境的产酸性蛋白酶的高产菌株,利用生物手段达到替代SO2的目的。首先在自然环境下筛选产酸性蛋白酶菌株,经紫外线诱变选育产酸性蛋白酶高产菌株,之后对发酵培养基和培养条件进行优化,得到最佳产酶条件,并对所产酸性蛋白酶进行酶学性质研究,最后探索菌株发酵液在淀粉生产中玉米浸泡工艺的应用。具体研究内容和结果如下:1.针对产酸性蛋白酶的微生物以真菌为主,选取50℃±2℃的温度、pH值在3.5～5.5的培养条件下进行筛选,然后进行产酸性蛋白酶活力和淀粉酶活力的检测,由于所筛选出的菌株要应用到玉米淀粉生产中,所以要筛选出产酸性蛋白酶活力强,而产淀粉酶活力弱的菌株,最终确定T26为目的菌株。通过对T26的形态和菌落进行显微观察,并结合分子生物学鉴定技术,采用ITS序列扩增后测序得到长度为566 bp的基因序列,经同源性比对可确定菌T26属曲霉属（Aspergillus）烟曲霉（A. fumigates strain）。2.对筛选出的菌种T26进行紫外（UV）诱变,选取适宜剂量诱变后的菌株进行产酸性蛋白酶活力的筛选,并进行产酶稳定性试验,得到突变株UV11,酶活力水平提高到6680 u/ml。接下来对发酵培养基和培养条件进行优化,得到最优发酵条件为:豆饼粉4 %,麸皮8 %,氯化铵3 %,磷酸氢二钾0.2 %,氯化钙0.5 %,初始pH值为5,接种量为1.5 %,50±2℃发酵培养5 d。3.通过对所得粗酶的酶学性质进行研究,主要是研究酶的适宜pH值、适宜底物浓度、适宜温度和热稳定性等特性。得到由UV11所产的酸性蛋白酶最适合pH为4.5,适宜酪蛋白底物浓度为2 %,适宜温度为50℃,并具有较高的稳定性,其酶学性质为后续的应用环节奠定了理论基础。4.在实验室条件下,对传统玉米淀粉生产的浸泡环境进行工艺条件的改良,得出酶法加工工艺的最佳浸泡工艺条件为:玉米首先在温度50℃、乳酸0.5 %、SO2 0.08 %的条件下初次浸泡12 h后,去皮去胚,添加12 %突变株UV11发酵液后进行二次浸泡,需再次浸泡10 h。与传统湿法加工工艺相比,采用添加发酵液的新工艺的浸泡时间缩短了26 h,且新工艺得到的淀粉符合淀粉的品质规定,并能提高各组分回收率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 选题的目的和意义
• 1.2 国内外现状和发展趋势
• 1.2.1 玉米深加工
• 1.2.2 玉米淀粉概况
• 1.2.2.1 玉米籽粒结构
• 1.2.2.2 玉米淀粉用途
• 1.2.2.3 玉米淀粉加工工艺
• 1.2.3 蛋白酶应用现状
• 1.2.4 微生物酶的特点
• 1.2.5 微生物的诱变育种
• 1.2.5.1 紫外线照射
• 1.2.5.2 γ-射线
• 1.2.5.3 微波
• 1.2.5.4 离子注入
• 1.2.5.5 亚硝基胍
• 1.2.6 酶法加工工业
• 1.3 本文研究的主要内容
• 第2章 产酸性蛋白酶菌种的筛选和鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要培养基
• 2.2.3 溶液配制
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 菌株的筛选
• 2.3.2 菌株的牛奶平板鉴定
• 2.3.3 菌株的淀粉平板鉴定
• 2.3.4 酶活力的测定
• 2.3.5 菌株的生长曲线
• 2.3.6 菌种的常规鉴定
• 2.3.7 ITS 序列鉴定
• 2.3.7.1 基因组DNA 提取
• 2.3.7.2 ITS 序列同源性分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌株的筛选
• 2.4.2 菌株的平板鉴定
• 2.4.3 酶活力的测定
• 2.5 菌种生长曲线的绘制
• 2.6 菌种的鉴定
• 2.6.1 菌落和菌株形态观察
• 2.6.2 分子生物学菌种鉴定
• 2.7 讨论
• 2.8 本章小结
• 第3章 菌株的诱变选育发酵条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要培养基
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 诱变处理
• 3.3.1.1 孢子悬浮液制备
• 3.3.1.2 紫外线（UV）诱变处理
• 3.3.2 发酵条件优化
• 3.3.2.1 不同碳源对菌株产酶的影响
• 3.3.2.2 不同氮源对菌株产酶的影响
• 3.3.2.3 不同磷酸盐对菌株产酶的影响
• 3.3.2.4 不同初始pH 值对菌株产酶的影响
• 3.3.2.5 正交试验优化
• 3.3.2.6 接种量对菌株产酶的影响
• 3.3.2.7 发酵时间对菌株产酶的影响
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 紫外线（UV）诱变菌体
• 3.4.2 产酶条件的优化
• 3.4.2.1 碳源对产酶的影响
• 3.4.2.2 有机氮源对产酶的影响
• 3.4.2.3 无机氮源对产酶的影响
• 3.4.2.4 磷酸盐对产酶的影响
• 3.4.2.5 不同初始pH 值对发酵产酶的影响
• 3.4.2.6 正交试验优化结果
• 3.4.2.7 接种量对产酶的影响
• 3.4.2.8 发酵培养时间对产酶的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第4章 酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要试剂
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 酶的适宜作用pH
• 4.3.2 适宜底物浓度
• 4.3.3 适宜作用温度
• 4.3.4 酶的热稳定性
• 4.3.5 酶的pH 稳定性
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 酶的适宜作用pH
• 4.4.2 适宜底物浓度
• 4.4.3 适宜作用温度
• 4.4.4 酶的热稳定性
• 4.4.5 酶的pH 稳定性
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第5章 菌株发酵液在玉米淀粉浸泡中的应用
• 5.1 引言
• 5.2 试验材料
• 5.2.1 玉米
• 5.2.2 发酵液
• 5.2.3 主要试剂
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 玉米湿磨工艺流程
• 5.3.2 玉米籽粒吸水影响因素
• 5.3.2.1 温度对玉米籽粒吸水率的影响
• 5.3.2.2 不同浸泡液对玉米籽粒吸水率的影响
• 5.3.3 发酵液浸泡中各因素对淀粉得率的影响
• 5.3.3.1 浸泡温度对淀粉得率的影响
• 5.3.3.2 发酵液添加量对淀粉得率的影响
• 5.3.3.3 浸泡液初始pH 值对淀粉得率的影响
• 5.3.3.4 玉米浸泡正交试验
• 5.3.4 新工艺与传统工艺的比较
• 5.3.4.1 新工艺与传统各组分产率的比较
• 5.3.4.2 淀粉含水量的测定
• 5.3.4.3 淀粉溶液透光率的测定
• 5.3.5 淀粉品质的检测
• 5.3.5.1 淀粉感官试验
• 5.3.5.2 淀粉理化试验
• 5.3.5.3 淀粉品质参照指标
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 玉米籽粒吸水性影响因素
• 5.4.1.1 温度对玉米籽粒吸水率的影响
• 5.4.1.2 不同浸泡液对玉米籽粒吸水性的影响
• 5.4.2 发酵液浸泡中各因素对淀粉得率的影响
• 5.4.2.1 浸泡温度对淀粉得率的影响
• 5.4.2.2 发酵液添加量对淀粉得率的影响
• 5.4.2.3 浸泡液初始pH 值对淀粉得率的影响
• 5.4.2.4 玉米浸泡正交试验设计
• 5.4.3 新工艺与传统工艺的比较
• 5.4.3.1 新工艺与传统各组分产率的比较
• 5.4.3.2 淀粉含水量的测定
• 5.4.3.3 淀粉溶液透光率的测定
• 5.4.4 淀粉品质检测
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢