恒温基因扩增技术对饲料沙门氏菌检测的研究

论文摘要

沙门氏菌(Salmonella)作为需氧革兰氏阴性无芽胞杆菌,广泛存在于自然环境中,寄生于人和动物的肠道内,通过污染食品和水源,传染致发急慢性胃肠疾病,对人畜健康均有较大的危害。动物性饲料作为沙门氏菌的“非生物贮主”,在动物和人类沙门氏菌病的发生、传播及新菌型引进上具有重要作用。鉴此,本论文进行了三个方面的研究:沙门氏菌环媒恒温扩增技术(LAMP)的建立及该方法用于饲料沙门氏菌的检测;用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变对LAMP特异性进行研究;沙门氏菌解旋恒温基因扩增技术(HDA)的建立及该方法用于饲料沙门氏菌的检测,结果如下:以沙门氏菌invA基因为目的片段设计特异性引物,通过条件优化,成功建立了沙门氏菌LAMP、HDA法,并通过用标准株和其他病原菌考核其特异性,用稀释法考核灵敏度。采集长沙附近饲料厂、养殖场108份饲料用LAMP、HDA法进行检测,同时以常规分离培养鉴定法进行对照。LAMP检出沙门氏菌阳性20份,阳性率为18.5%(20/108),HDA检出沙门氏菌阳性19份,阳性率为17.6%(19/108),常规法检出沙门氏菌阳性21份,阳性率19.44%(21/108)。两种方法与常规法的阳性符合率分别是90.48%、95.24%,阴性符合率100%。HDA产物克隆后送公司进行测序,结果阳性菌株克隆的DNA序列与GenBank中发表的入侵因子基因序列相同。表明建立的LAMP法、HDA法检测沙门氏菌具有快速、简便、特异、灵敏等特点,极适合基层实验室使用,具有广阔的推广前景。采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。扩增结果为阴性,原引物不可扩增突变模板。LAMP技术不能利用同一引物,检测具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,而具有可区分它们的能力,这种结果与内引物在环媒恒温基因扩增技术中至关重要的作用有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 沙门氏菌及其研究进展
• 1.1 沙门氏菌的生物学特性
• 1.2 沙门氏菌分类
• 1.3 沙门氏菌的毒理作用及危害
• 1.4 沙门氏菌的主要检测方法
• 2 解旋恒温基因扩增技术及其应用研究进展
• 2.1 HDA法的原理
• 2.2 HDA的操作步骤
• 2.3 HDA技术与其他基因扩增技术的比较
• 3 环介导等温基因扩增技术研究进展
• 3.1 LAMP法的原理
• 3.2 LAMP的操作步骤
• 3.3 LAMP的进展
• 第二章 环媒恒温基因扩增（LAMP）检测沙门氏杆菌的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 LAMP检测方法的建立
• 2.2 LAMP的条件优化
• 2.3 LAMP特异性试验
• 2.4 LAMP敏感性试验
• 2.5 产物检测简化试验
• 2.6 LAMP样品检测结果
• 3 讨论
• 3.1 靶基因及选用
• 3.2 LAMP法建立的技术要点
• 3.3 LAMP的条件优化
• 4 小结
• 第三章 内引物在环媒恒温基因扩增技术中作用的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 具有点突变模板的制备
• 2.2 LAMP扩增结果
• 3 讨论
• 第四章 解旋恒温基因扩增（HDA）检测沙门氏杆菌的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 HDA检测方法的建立
• 2.2 HDA条件的优化
• 2.3 HDA敏感性试验
• 2.4 HDA特异性试验
• 2.5 阳性克隆的鉴定与序列分析
• 2.6 样品检测
• 3 讨论
• 3.1 HDA快速检测方法
• 3.2 靶基因及选用
• 3.3 小结
• 3.4 展望
• 第五章 结论及下一步工作设想
• 1 结论
• 2 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介