表达弓形虫SAG1伪狂犬病病毒的构建及免疫研究

论文摘要

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患的弓形虫病。由于弓形虫生活史复杂,传播途径多样,对弓形虫的治疗,特别是弓形虫包囊,迄今尚未有理想药物。因此弓形虫疫苗已成为弓形虫病防治研究的重点。为构建表达弓形虫SAG1基因的重组伪狂犬病病毒,本研究利用PCR技术扩增弓形虫主要保护性抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1,将含有SAG1基因的表达盒克隆入伪狂犬病病毒基因缺失转移载体,经同源重组获得了表达弓形虫SAG1基因的重组伪狂犬病病毒。真核表达载体的构建利用PCR技术扩增出弓形虫主要保护性抗原基因SAG1,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,经酶切鉴定及序列分析,构建真核表达载体pcDNA/SAG1。重组伪狂犬病毒的构建真核表达载体pcDNA/SAG1经双酶切获得SAG1基因表达盒（上游为CMV启动子,下游为BGH ployA信号）,并将其克隆入伪狂犬病病毒转移载体p8KD,构建中间转移载体p8KD/SAG1。利用脂质体转染方法,将中间转移载体p8KD/SAG1与伪狂犬病毒rPRV/LacZ基因组共转染Vero细胞,经蓝白斑筛选,获得携带SAG1基因的重组伪狂犬病病毒rPRV/SAG1。重组伪狂犬病毒的鉴定分别提取重组病毒rPRV/SAG1基因组DNA和总RNA,运用SAG1特异性引物进行PCR及RT-PCR,结果扩增出特异性目的条带。经Western blot和间接免疫荧光试验证实,重组病毒表达的SAG1蛋白能被抗弓形虫的多克隆阳性血清识别。重组病毒rPRV/SAG1的稳定性试验表明,该病毒在体外连续传20代,仍能检测到SAG1的表达,说明rPRV/SAG1具有较好的遗传稳定性。动物保护性试验为鉴定rPRV/SAG1的免疫保护效果,以BALB/c小鼠进行了免疫保护性试验。结果表明,真核表达载体pcDNA/SAG1及重组病毒rPRV/SAG1能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体,产生较高水平的IL-2和IFN-γ;并且pcDNA/SAG1首免,rPRV/SAG1加强免疫能诱导更高水平的IL-2和IFN-γ。免疫小鼠感染弓形虫后生存时间明显延长,并且rPRV/SAG1免疫组获得60%的保护率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 弓形虫疫苗的研究进展
• 1 弓形虫全虫疫苗
• 2 基因工程疫苗
• 3 核酸疫苗
• 4 活载体疫苗
• 5 研究展望
• 第二章 伪狂犬病毒的研究进展
• 1 伪狂犬病毒的分子生物学研究
• 2 伪狂犬病毒载体的研究进展
• 3 伪狂犬病毒疫苗研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第一章 弓形虫SAG1的克隆及真核表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 表达弓形虫SAG1的重组伪狂犬病病毒的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 弓形虫SAG1重组伪狂犬病病毒的免疫保护试验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介