橡胶树UBI基因的克隆与表达分析

论文摘要

乙烯是一种具广谱作用的植物激素,在植物的各个生长发育时期都有重要的调控作用。上世纪60年代末,人们发现乙烯利（分解可以释放出乙烯）可以刺激橡胶树增产,随后将此技术迅速应用于生产并取得了巨大的经济效益。在推广应用此项技术的同时,植胶国的科技工作者从产胶生理、生化等角度,对乙烯利刺激橡胶树增产的机制进行了大量的研究,同时发现,乙烯利刺激加速橡胶树乳管衰老、促进橡胶树死皮病的发生等。但关于乙烯利作用的分子机制、在这些过程中扮演的真正角色目前并不清楚。为解析乙烯利刺激巴西橡胶树橡胶增产及加速乳管衰老的分子机制,本论文开展了如下研究并取得了部分研究结果:1、利用SSH技术成功构建了乙烯利刺激的橡胶树胶乳抑制差减文库,获取了118个阳性克隆。对随机选取的25个克隆进行的测序及序列分析表明,大部分基因序列属于未知或未知功能蛋白序列,只有少量的EST可以在模式植物中找到高度同源的对应基因。这暗示,可能有相当多的未知功能基因参与了乙烯利刺激橡胶树橡胶增产、加速乳管衰老的过程。2、生物信息学分析表明,NO.84EST与Ubiquitin基因具有较高的同源性。为获得该基因的全长序列,设计了5’RACE特有引物,运用SMART-RACE技术获得了该基因全长,命名为UBI。UBI基因cDNA全长核苷酸序列为771bp,拥有一个468bp的开放阅读框架,编码156个氨基酸。其中,5`UTR有77个核苷酸,3`UTR有226个核苷酸。核酸序列比对分析表明,UBI基因是一个Ubiqution extension protein基因,与其它来源的相应基因同源性在78%-90%之间;氨基酸序列同源性高达87.18%- 100%。3、利用Southern杂交技术对UBI基因的拷贝数进行了检测,结果表明该基因在橡胶树基因组中以单拷贝形式存在。以未处理、乙烯利处理3h、6h、12h、24h 5个时间段的橡胶树胶乳RNA为模板,以橡胶树Actin基因为内参基因,应用半定量PCR技术检测了基因的表达情况。结果显示,乙稀利处理12h,UBI基因表达最强,之后24h开始下降。这一结果暗示,该基因可能参与了乙烯信号的转导过程。4、建立了一种高效快速的橡胶树胶乳总RNA提取方法。紫外分光光度计和RT-PCR、RACE等分析结果表明,使用该方法提取的RNA质量完全能够满足相应的分子操作,但所需时间却只有目前常用方法的50%,RNA得率提高了2-3倍。本方法具有操作简便、用时少、得率高、提取的RNA质量好等特点,具有较强的实用性和可靠性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 乙烯利与天然橡胶生产
• 1.1.1 乙烯利刺激橡胶树增产及其分子生物学研究
• 1.1.2 乙烯利刺激橡胶树增产的副作用
• 1.2 CDNA 差减文库构建及在橡胶树分子生物学研究中的应用
• 1.2.1 利用SSH（suppression subtractive hybridization）技术构建cDNA 差减文库
• 1.2.2 cDNA 差减文库在解析橡胶树产胶基因中的应用
• 1.2.3 cDNA 差减文库在解析茉莉酸刺激乳管分化和胶乳合成中的应用..
• 1.2.4 cDNA 差减文库在解析乙烯利刺激橡胶树增产过程中的应用
• 1.3 泛素蛋白酶体降解系统研究
• 1.3.1 泛素的结构和功能
• 1.3.2 泛素-蛋白酶体降解途径
• 1.3.3 泛素蛋白酶体降解系统与乙烯利刺激橡胶树增产
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 技术路线
• 1.6 相关技术图解
• 1.6.1 SSH 技术
• 1.6.2 SMART-RACE 技术
• 2 乙烯利刺条件下橡胶树胶乳差异表达CDNA 文库存的构建与分析（此部分与刘宽灿合作完成）
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 胶乳总RNA 提取
• 2.2.2 RNA 电泳检测
• 2.2.3 m RNA 的纯化
• 2.2.4 橡胶树胶乳差异表达分析（SSH）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 橡胶树胶乳Total RNA 的提取结果
• 2.3.2 橡胶树胶乳的表达差异SSH 结果
• 3 橡胶树UBI 基因全长CDNA 的克隆、基因结构及其表达分析
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 菌种及质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 胶乳总RNA 提取（参照4.2）
• 3.2.2 差异片段全长cDNA 克隆
• 3.2.3 Southern 杂交
• 3.2.4 UBI 基因在乙烯刺激后不同时期的表达分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 NO.84 差异表达基因全长cDNA 序列克隆
• 3.3.2 cDNA 序列及其ORF 分析结果
• 3.3.3 Southern 杂交鉴定基因组中拷贝数
• 3.3.4 半定量PCR 进行初步的表达分析
• 4 一种快速、高效的橡胶树胶乳总RNA 提取方法
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 RNA 提取缓冲液配制
• 4.1.4 器皿使用及消毒
• 4.2 胶乳总RNA 提取方法及步骤
• 4.3 RNA 质量检测
• 4.3.1 普通琼脂糖凝胶电泳分析
• 4.3.2 紫外分光光度计分析
• 4.3.3 应用于RT－PCR 检测分析
• 4.3.4 应用于RACE 技术克隆基因
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 RNA 完整性分析
• 4.4.2 RNA 纯度检测及得率分析
• 4.4.3 RT-PCR 检测
• 4.4.4 应用本方法提取的RNA 可以满足RACE 技术操作的要求
• 5 讨论
• 5.1 SSH CDNA 差减文库构建
• 5.2 橡胶树UBI 基因的功能及表达分析
• 5.3 橡胶树胶乳总RNA 提取方法的改良
• 6 结论
• 7 参考文献
• 致谢