论文摘要
目的:研究颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）大鼠学习记忆障碍以及其与前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）中胆碱乙酰基转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）免疫反应活性变化的关系,初步探讨癫痫合并学习记忆障碍的神经机制,并为癫痫合并学习记忆障碍的临床治疗提供依据。探讨蝎毒耐热蛋白（Scorpion Venom heat-resistance protein,SVHRP）对红藻氨酸（kainic acid,KA）TLE大鼠空间学习记忆能力的保护和治疗作用,以及对PFC中ChAT免疫阳性神经元的保护作用。方法:选取健康SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠50只。随机选取10只作为盐水对照组（NS+NS,n=10）。其余40只大鼠颈部皮下注射致癫痫剂量（10mg/kg,5mg/ml）KA,选取癫痫发作4-5级的大鼠共计34只,把34只大鼠按随机原则平分为2组,即KA+SVHRP组和KA+NS组。接下来的10天中,给KA+SVHRP组大鼠每天同一时间腹腔注射SVHRP（0.25mg/kg,50μg/ml,5ml/kg）,KA+NS组和NS+NS组每天腹腔注射等量生理盐水。注射10天后,各组大鼠颈部皮下注射阈下剂量KA（5mg/kg,5mg/ml）,检测癫痫敏感性。统计4-5级发作大鼠的数量。用Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）测定大鼠空间学习记忆能力。处死大鼠,取脑。免疫组织化学方法（ABC法）测定PFC中ChAT免疫阳性神经元的数量,间接反映脑内乙酰胆碱（acetylcholine,Ach）含量。结果:注射阈下剂量（5mg/kg）KA后,NS+NS大鼠未见4-5级癫痫样发作;KA+NS大鼠中有10只出现4-5级发作,其中5级发作5只,4级发作5只,3级发作1只,2级发作1只,1级发作0只,0级0只;KA+SVHRP组有1只大鼠出现4-5级癫痫样发作,其中5级发作0只,4级发作1只,3级发作2只,2级发作2只,1级发作4只,0级5只。敏感性检验后,选取KA+NS组中发作4-5级的存活大鼠,为TLE模型组;选取KA+SVHRP组中未发生4-5级发作的存活大鼠,为SVHRP治疗组。KA+NS组为10只,KA+SVHRP组为13只。经有序变量的秩和检验,发现KA+SVHRP大鼠的发作级别明显小于KA+NS组,差异有显著性（P<0.05）,提示SVHRP对KA诱导的癫痫敏感性形成有明显抑制作用。MWM测试显示,时间因素（day）有统计学意义（F=166.193,P<0.05）,说明潜伏期有随时间变化的趋势;时间和分组的交互作用（day×group）有统计学意义（F=23.706,P<0.05）,说明时间因素的作用随着分组的不同而不同。3个分组的F=237.926,P<0.05,说明分组因素起作用,各组潜伏期指标总体而言不同。在5天的定位航行试验（place test）中,在第1、2、3、4、5天,KA+NS（n=10）组比NS+NS（n=10）组的潜伏期（latency）明显延长,具有显著差异（P<0.01）;KA+SVHRP（n=13）组潜伏期较KA+NS组缩短,有显著差异（P<0.01）,而与NS+NS组没有显著差异。提示KA诱导的TLE动物空间学习能力明显降低,SVHRP治疗后可以改善KA导致的空间学习能力损伤。大鼠在MWM中目标象限和对侧象限中游泳时间所占百分比结果显示,在空间探索试验（spatial probe test）中盐水对照组典型搜索策略为优势搜索策略;KA致TLE大鼠典型搜索策略为边缘策略。TLE大鼠穿越平台的次数为0.70±0.67次,盐水组为3.30±1.64次,SVHRP治疗组为2.54±0.97次。3组之间的F=13.727,P<0.05,说明组间差异有显著性。KA+NS组大鼠比盐水对照组大鼠穿越平台次数明显减少（P<0.05）,提示KA致TLE大鼠的空间记忆能力下降;而KA+SVHRP组大鼠穿越平台次数较KA+NS组大鼠有明显提高（P<0.05）,提示SVHRP可以改善KA致TLE大鼠下降的空间记忆能力。免疫组织化学结果显示,在面积为3120.4μm2的测量框内,NS+NS组大鼠ChAT免疫反应阳性胆碱能神经元数目为19.70±3.75个,KA+NS组为11.80±4.31个,KA+SVHRP组为12.94±3.40个。KA+NS组PFC中ChAT阳性神经元的数目比盐水组明显减少（P<0.05）,提示KA致TLE可损伤PFC中胆碱能神经元;KA+SVHRP组ChAT阳性神经元的数目比KA+NS组有所提高,但无显著性差异, SVHRP不能有效提高TLE大鼠PFC中减少的ChAT阳性神经元数目,提示SVHRP可能不能有效改善因注射KA所致的PFC中胆碱能神经系统的损伤。结论:KA致TLE组大鼠学习记忆能力明显降低,PFC中ChAT免疫阳性神经元数目明显减少,提示KA所致的TLE可损伤动物的空间学习记忆能力。SVHRP可以改善TLE大鼠损伤了的学习记忆能力,但是对TLE导致的PFC中ChAT阳性神经元的损伤没有明显保护作用。提示KA致TLE大鼠空间学习记忆障碍的形成与PFC中ChAT阳性神经元的减少以及PFC中乙酰胆碱系统受到损伤有关。SVHRP可以改善TLE造成的学习记忆损害,而对于PFC中的受损的胆碱能神经元不能很好的发挥治疗和改善作用。提示SVHRP可能通过提高脑内除PFC脑区之外的ChAT免疫阳性神经元的数目,来发挥其改善大鼠在行为学中由于KA所致癫痫造成的空间学习记忆能力损伤。关于包括PFC在内的脑区中胆碱能神经元在动物空间学习记忆中的作用,有待于进一步探讨。本实验对于进一步明确TLE的发病机制和指导临床上癫痫合并学习记忆障碍的治疗具有重要意义。