骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞分化过程中结构蛋白发育的实验研究

论文摘要

背景:随着干细胞移植治疗心脏疾病的研究不断深入,骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）由于具有易获得、易扩增、几乎无移植物抗宿主反应、无伦理道德限制等优点,成为目前研究的热点。体外诱导和体内移植方面均取得了令人鼓舞的成就[1-3],本课题组前期研究发现:BMMSCs 体外经 5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导后能表达心脏发育早期转录因子 GATA4,NKx2.5,骨骼肌增强因子-2C和转化生长因子-β等[2]; BMMSCs移植入心肌病模型鼠体内,病鼠心功能明显改善 。但在对 BMMSCs 移植后心功 [3]能改善的机理探讨中还存在很大的争议,争议的焦点在于移植后的BMMSCs 能否分化成具有正常心肌细胞结构并具备主动收缩功能的细胞。由于无法直接在宿主心肌内观察移植细胞的收缩,就现阶段的技术水平而言,只有从侧面去间接说明这一点。即建立体外诱导模型,阻断心肌特异结构蛋白肌联蛋白 titin 基因的表达,以此来观察诱导后的BMMSCs是否还能分化成具有相应结构及具有收缩功能的心肌样细胞。 目的:构建能干扰正常心肌细胞结构蛋白 titin 的重组质粒,将其转染入经 5-aza 诱导后的 BMMSCs,观察 BMMSCs 能否进一步分化成心重庆医科大学硕士研究生学位论文 4肌样细胞并表达 titin、肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）、肌动蛋白 actin、心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T,cTnT）等心肌特异蛋白标志物,同时就 titin 在心肌结构蛋白发育和肌小节组装过程中所起的作用进行初步探讨。材料和方法:1. 分别构建携带针对 Wistar 大鼠 titinN2B 区设计的 siRNA 重组质粒 pSITITIN 和携带针对人β-actin 设计的 siRNA 重组质粒pSIACTIN,利用脂质体将其转染入体外分离培养 1w 的正常新生 Wistar大鼠心肌细胞中,免疫荧光检测 titin 的表达情况。2. 将上述重组质粒分别转染入经 5-aza 诱导后 2w 的 BMMSCs,免疫荧光检测 titin 的表达情况。3. 免疫荧光检测 titin 被阻断后 MHC、actin、cTnT 的表达情况 。结果:1. 酶切和 DNA 序列测定证实重组质粒构建成功。2. 重组质粒 pSITITIN 转染入正常新生鼠心肌细胞后,titin 的表达减弱（P<0.001）。而对照 pSIACTIN 转染入正常新生鼠心肌细胞后,titin 的表达无明显变化（P>0.05）。3. 重组质粒 pSITITIN 转染入经 5-aza 诱导后 2w 的 BMMSCs 后,titin 的表达减弱。而对照 pSIACTIN 转染入经 5-aza 诱导后 2w 的BMMSCs 后,titin 的表达无明显变化。titin 的表达被阻断后,MHC、actin 的表达无明显变化,cTnT 的表达减弱。结论:

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞分化过程中结构蛋白发育的实验研究
• 第一部分 titin N2B 区siRNA 表达载体的构建
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第二部分 pSITITIN 在新生鼠心肌细胞中的表达
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第三部分 BMMSCs 体外诱导及titin RNAi
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 全文结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文