生菜遗传转化体系的建立及禽流感抗原基因NA和HA的导入

论文摘要

禽流感（Avian influenza,AI）是由流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病,是危害禽类健康的重要传染病之一。目前,利用转基因植物生产可食疫苗己成为转基因植物研究的一个热点。而HA和NA是禽流感病毒重要的保护性抗原基因,可激发机体产生中和抗体,有效保护畜禽。以生菜作为生物反应器来大规模生产可食植物疫苗,具有重要的理论和实践价值。本研究以pBI121质粒为基础,分别构建了含有NA/HA基因的植物双元表达载体pBI121-NA和pBI121-HA。采用农杆菌介导的遗传转化方法研究将禽流感抗原基因NA和HA转入生菜。研究结果如下:1.已成功构建了含有NA/HA基因的植物双元表达载体pBI121-NA和pBI121-HA。2.以生菜（Lactuca sativa var.capatatata L.）为转化受体材料,通过研究预培养时间、浸染时间、共培养时间、农杆菌浓度及卡那霉素选择压对农杆菌介导法转化生菜的影响,建立并优化了高效遗传转化体系。转化体系:生长3d生菜子叶在农杆菌菌液浓度OD600值为0.4～06浸染15min,共培养2～3d后,转入含有100mg/L头孢霉素和110mg/L卡那霉素的培养基上进行诱导筛选。3.通过农杆菌介导法转化生菜,已经获得卡那霉素抗性苗105株,用特异引物对抗性植株进行PCR检测,其中6株为转基因植株。并对转基因植株进行GUS染色,转基因植株的叶片,茎段均被染上蓝色。通过RT-PCR检测的方法,转基因植株得到进一步验证。证明了外源基因不仅已整合到了生菜基因组中,而且能够正常表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 植物遗传转化研究进展
• 1.1 农杆菌介导法
• 1.2 受体材料的选择
• 1.3 影响转化效率的因素
• 1.4 转化体的筛选和鉴定
• 2 植物生物反应器生产药用蛋白现状和前景
• 3 禽流感病毒及其疫苗
• 4 生莱遗传转化体系研究现状
• 5 转基因安全性考虑
• 6 本研究的目的与意义
• 第二章 禽流感抗原基因NA和HA的克隆及其表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒与载体
• 1.3 培养基
• 1.4 抗生素
• 1.5 分子生物学试剂
• 2 方法
• 2.1 提取含禽流感抗原基因NA和HA的质粒
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.3 双元表达载体pBI121-NA和pBI121-HA的构建
• 2.4 表达载体转化进农杆菌
• 2.5 技术路线
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因的克隆和鉴定
• 3.2 表达载体的构建和鉴定
• 3.3 表达载体转化进农杆菌
• 4 讨论
• 第三章 生菜遗传转化体系的建立及转化
• 1 材料
• 1.1 供试材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 培养条件
• 2.2 工程菌的制备
• 2.3 卡那霉素梯度筛选
• 2.4 头孢霉素梯度筛选
• 2.5 生菜遗传转化体系的优化
• 2.6 生菜遗传转化的方法
• 2.7 转化子的筛选
• 2.8 生菜转化和再生过程
• 3 结果与分析
• 3.1 卡那霉素和头孢霉素对生菜子叶分化能力的影响
• 3.2 生菜遗传转化体系的优化
• 3.3 转基因生菜的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 生菜子叶高效遗传转化体系的建立
• 4.2 再生苗的分化
• 4.3 转化苗中的嵌合体
• 第四章 总结与展望
• 参考文献
• 缩写词（Abbreviation）
• 致谢
• 作者简介