人血管内皮抑素诱导内皮细胞凋亡的机理研究

论文摘要

血管内皮抑制素自1997年被分离和发现以后,引起了世界各国科学家极大的研究兴趣,目前有上千篇文章关于血管内皮抑制素的各种报道,研究范围覆盖生物活性、蛋白结构与功能、作用分子机理等。血管内皮抑制素能够在体内外抑制肿瘤新生血管生成,目前已成为临床治疗肿瘤的最有效的内源性血管生成抑制剂类分子之一。血管内皮抑制素能够诱导内皮细胞发生凋亡,被认为是其抑制新生血管生成的重要机理之一。但是,目前对于这一过程的具体分子机理还不是非常清楚。在本文的研究中,我们通过研究血管内皮抑素诱导的内皮细胞凋亡,试图阐明在内皮细胞内与凋亡相关的信号转导通路及分子作用机理。我们证明血管内皮抑制素能够诱导人微血管内皮细胞在体外发生凋亡,诱导细胞色素c释放到细胞浆中,激活下游的Caspase-9。同时,细胞内ATP水平减少、线粒体跨膜电位降低、细胞内活性氧的产生等实验证明线粒体失活参与了凋亡的调控。进一步研究发现血管内皮抑素诱导线粒体通透性转变孔开放,而线粒体外膜上的VDAC1蛋白在调控开放过程中发挥重要作用,血管内皮抑素诱导VDAC1蛋白量增加。当我们干扰VDAC1后,发现血管内皮抑素的促凋亡作用受到抑制。而过量表达VDAC1后,Caspase-9的激活,活性氧的释放等凋亡事件发生的几率增加,证明VDAC1在血管内皮抑素促进细胞凋亡的过程中发挥重要的调控作用。同时,我们发现血管内皮抑素能够诱导己糖激酶HK2表达量下调,诱发了VDAC1的蛋白量上调以及相应的细胞凋亡。我们进一步证明血管内皮抑素诱导VDAC1发生磷酸化,VDAC1上的Ser-12, Ser-103可能是发生磷酸化的位点。功能实验证明,Ser-12和Ser-103的去磷酸化突变体抑制血管内皮抑素诱导的VDAC1的蛋白量的增加、线粒体通透性转变孔的开放和Caspase-3的激活,证明了VDAC1的磷酸化在血管内皮抑素诱导凋亡中所起的关键作用。我们的研究完善了对于血管内皮抑素诱导的内皮细胞凋亡机理的理解,对抗新生血管生成药物的临床应用具有一定的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 新生血管生成概述
• 1.2 新生血管生成领域研究进展
• 1.3 新生血管生成与肿瘤的关系
• 1.3.1 肿瘤新生血管生成领域相关进展
• 1.3.2 新生血管生成调控因子
• 1.4 血管内皮抑制素作用机理的相关研究
• 1.5 内皮细胞凋亡与新生血管生成的关系
• 1.5.1 新生血管生成因子调控内皮细胞凋亡
• 1.5.2 细胞外基质、细胞黏附参与内皮细胞凋亡的调控
• 1.6 本文的主要研究内容和贡献
• 1.6.1 本文的主要研究内容
• 1.6.2 本文的主要贡献
• 第2章 血管内皮抑制素在体外诱导内皮细胞凋亡
• 2.1 本章引言
• 2.2 实验中使用的内皮细胞介绍
• 2.3 Annexin-V 检测血管内皮抑制素诱导的内皮细胞凋亡
• 2.3.1 实验步骤
• 2.3.2 实验结果
• 2.4 TUNEL 实验检测血管内皮抑制素诱导的内皮细胞凋亡
• 2.4.1 实验步骤
• 2.4.2 实验结果
• 2.5 Caspase 激活实验检测血管内皮抑制素诱导的内皮细胞凋亡
• 2.5.1 实验步骤
• 2.5.2 实验结果
• 2.6 血管内皮抑制素诱导内皮细胞中细胞色素 c 的释放
• 2.6.1 免疫荧光方法检测细胞色素c 的释放
• 2.6.2 免疫印迹方法检测细胞色素c 的释放
• 2.7 细胞色素 c 的释放激活下游的 Caspase-9
• 2.8 本章小结
• 第3章 血管内皮抑素诱导线粒体失活介导细胞凋亡
• 3.1 本章引言
• 3.2 血管内皮抑制素诱导细胞内ATP 水平降低
• 3.2.1 实验步骤
• 3.2.2 实验结果
• 3.3 血管内皮抑制素诱导线粒体跨膜电位降低
• 3.3.1 实验步骤
• 3.3.2 实验结果
• 3.4 血管内皮抑制素诱导线粒体形态发生改变
• 3.4.1 实验步骤
• 3.4.2 实验结果
• 3.5 血管内皮抑制素诱导活性氧的形成
• 3.5.1 实验步骤
• 3.5.2 实验结果
• 3.6 血管内皮抑制素诱导线粒体通透性转变孔的开放
• 3.6.1 实验步骤
• 3.6.2 实验结果
• 3.7 线粒体通透性转变孔抑制剂抑制血管内皮抑制素诱导的凋亡
• 3.7.1 实验步骤
• 3.7.2 实验结果
• 3.8 线粒体通透性转变孔抑制剂在体外调控新生血管生成
• 3.8.1 实验步骤
• 3.8.2 实验结果
• 3.9 本章小结
• 第4章 VDAC1 蛋白参与调控血管内皮抑素诱导的凋亡
• 4.1 本章引言
• 4.2 血管内皮抑素促进内皮细胞的 VDAC1 蛋白表达量升高
• 4.3 血管内皮抑素处理后线粒体上相关蛋白的变化
• 4.3.1 实验步骤
• 4.3.2 实验结果
• 4.4 干扰VDAC1 抑制血管内皮抑素诱导的细胞凋亡
• 4.4.1 RNA 干扰的分子机制
• 4.4.2 Annexin-V 实验检测干扰 VDAC1 对血管内皮抑素活性的抑制
• 4.4.3 干扰 VDAC1 抑制血管内皮抑素诱导的 Caspase-9 的激活
• 4.5 过量表达VDAC1 能促进内皮细胞凋亡
• 4.5.1 过量表达 VDAC1 在体外抑制新生血管生成
• 4.5.2 过量表达 VDAC1 诱导内皮细胞 Caspase-9 激活
• 4.5.3 过量表达 VDAC1 诱导内皮细胞活性氧释放
• 4.6 本章小结
• 第5章 己糖激酶调控 VDAC1 的表达
• 5.1 本章引言
• 5.2 血管内皮抑素抑制内皮细胞的HK2 表达
• 5.2.1 实验步骤
• 5.2.2 实验结果
• 5.3 血管内皮抑素抑制内皮细胞中VDAC1 与HK2 的结合
• 5.3.1 实验步骤
• 5.3.2 实验结果
• 5.4 siRNA 干扰内皮细胞 HK2 的表达
• 5.4.1 实验步骤
• 5.4.2 实验结果
• 5.5 干扰内皮细胞HK2 的表达抑制细胞周期
• 5.5.1 实验步骤
• 5.5.2 实验结果
• 5.6 干扰内皮细胞HK2 的表达抑制细胞增殖
• 5.6.1 实验步骤
• 5.6.2 实验结果
• 5.7 干扰内皮细胞HK2 的表达促进细胞凋亡
• 5.7.1 实验步骤
• 5.7.2 实验结果
• 5.8 HK2 调控 VDAC1 的表达
• 5.8.1 HK2 降低会引起 VDAC1 蛋白量的升高
• 5.8.2 抑制HK2 的降低可消弱血管内皮抑素对于VDAC1 的作用
• 5.9 本章小结
• 第6章 VDAC1 的磷酸化调控其蛋白表达
• 6.1 本章引言
• 6.2 双向凝胶电泳检测VDAC1 蛋白的后修饰
• 6.2.1 实验步骤
• 6.2.2 实验结果
• 6.3 血管内皮抑素促进VDAC1 蛋白的磷酸化
• 6.3.1 实验步骤
• 6.3.2 实验结果
• 6.4 VDAC1 蛋白的磷酸化调控其蛋白表达量
• 6.4.1 VDAC1 蛋白的磷酸化位点研究
• 6.4.2 VDAC1 的去磷酸化能够抑制其蛋白表达量增加
• 6.4.3 VDAC1 的磷酸化可能抑制蛋白的降解
• 6.5 VDAC1 的去磷酸化抑制血管内皮抑素促进的蛋白量增加
• 6.5.1 实验步骤
• 6.5.2 实验结果
• 6.6 VDAC1 的去磷酸化抑制血管内皮抑素的活性
• 6.6.1 实验步骤
• 6.6.2 实验结果
• 6.7 VDAC1 的去磷酸化抑制血管内皮抑素诱导的细胞凋亡
• 6.8 本章小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果