微针阵列技术对不同理化性质药物的经皮促透作用

论文摘要

微针（Microneedle）透皮给药技术是在微电子机械系统（Micro ElectronicMechanical System,MEMS）加工技术与经皮促渗技术研究日益成熟发展起来的新型给药方式,微针阵列（Microneedle Array）具有尺度小、强度高、可精确控制刺入位置与深度以及无痛穿刺等优势。微针透皮给药是采用微米级尺寸的微针阵列作用于皮肤表面,穿刺角质层产生数百上千个微小孔洞,从而促进药物经皮渗透,此技术尤其为大分子药物（如多肽、蛋白质、疫苗等）的经皮传递提供了极具潜力的研究前景。本硕士课题选用不同材料进行微针阵列的制备,考察不同材料与形态的微针阵列对化学药物及生物大分子药物经皮传递的影响,对体外药物释放实验中药物渗透速率的不同影响因素进行考察,并对DNA乙肝疫苗的体外经皮渗透及体内经皮免疫效应进行研究。本文共有四部分内容组成:第一部分:微针阵列的制备与评价。本部分主要进行了实心微针的制备,分别为硅微针的制备及聚合物微针的制备。硅微针制备采用深反应离子刻蚀技术（DRIE）,加工成五角星型柱状结构及双层柱状结构,该方法较为成熟,运用广泛;聚合物微针采用SU-8为材料进行制备,最终得到异平面实心微针,该制作方法简便,成本较低,可作为一次性使用,具有很高的应用价值。本文自行设计制作了微针进针装置,方便体外透皮实验控制进针的时间及压力。经剪切力测定,本研究制备的微针阵列及进针装置能满足透皮实验研究条件,不会产生断裂及皮肤内残留。第二部分:微针阵列对化学药物的体外经皮促透作用。选用吲哚美辛（indomethacin IMC）、酮洛芬（ketoprofen KTP）、美索巴莫（methocarbamol MCM）、更昔洛韦（ganciclovir GCV）为模型药物,建立高效液相色谱法进行透皮给药后的药物浓度测定,对四种化学药物经硅微针穿刺皮肤后的体外透皮特性进行比较研究。实验结果显示,IMC、KTP、MCM、GCV经微针处理皮肤5min较未处理皮肤的渗透速率分别增加4.05、4.77、6.06、12.49倍,表明硅微针对四种模型药物有明显的促透作用;药物透皮传递随着微针穿刺皮肤时间的延长而增强;随着药物logP值降低,经微针处理皮肤的促透效果更强,表明微针对水溶性药物的促透效果较脂溶性药物更加显著。第三部分:微针阵列对生物大分子药物的体外经皮促透作用。选用胰岛素（Insulin）、溶菌酶（Lysozyme）、卵清白蛋白（Ovalbumin）、人血清白蛋白（Human Serum Albumen）为生物大分子模型药物,采用MicroBCA法对药物的体外经皮渗透的浓度进行测定,结果显示四种生物大分子药物经微针阵列穿刺皮肤后有明显透过。采用正交实验设计对微针透皮给药的影响因素进行考察,优化实验条件以得到较好的经皮渗透效果,选用优化条件对四种大分子药物进行体外经皮渗透实验,结果表明分子量与单位面积累计经皮透过量成反比。第四部分:DNA乙肝疫苗经微针皮肤给药的免疫效果评价。本部分实验首先对微针阵列用于空白质粒pVAX1的体外经皮渗透特性做一考察。为了增强DNA疫苗的体内免疫效果,采用微针阵列对DNA乙肝疫苗进行经皮给药,并联合基因佐剂Flt3L进行共免疫。对C57BL/6小鼠进行几种免疫策略的考察,ELISA法进行抗体水平检测,植入HBsAg-expressing CT/26细胞并观察C57BL/6小鼠存活率。结果表明,微针阵列能够促进质粒pVAX1的透皮传递,24h的经皮透过量达到给药量的25.26%。微针阵列经皮免疫较皮下注射免疫的抗体滴度显著增加,采用微针阵列法对DNA疫苗pVAX（S）协同基因佐剂Flt3L进行经皮免疫,比其他免疫方法可诱导更强的机体免疫。各组经过不同方式免疫后,皮下植入CT/26细胞,经pVAX（S）微针阵列免疫的小鼠第20周存活率为40%,为肌注免疫的两倍。本研究对增强抗HBV及其他病原体的DNA疫苗免疫提供了新策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 微针阵列的制备与评价
• 1 皮肤结构与微针阵列透皮作用机理
• 2 微针阵列的设计
• 2.1 基材的选择
• 2.2 加工方法的确定
• 2.2.1 硅微针阵列的加工方法
• 2.2.2 聚合物微针阵列的加工方法
• 3 微针阵列的制备
• 3.1 仪器与材料
• 3.2 方法与结果
• 3.2.1 硅微针阵列的制备
• 3.2.2 聚合物微针的制备
• 3.2.3 微针阵列进针装置
• 4 微针阵列的评价与结果
• 4.1 微针的剪切力评价
• 4.2 微针阵列局部穿刺后皮肤形态
• 5 总结与讨论
• 参考文献
• 第二部分 微针阵列对化学药物的体外经皮促透作用
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 2 方法与结果
• 2.1 药物的基本理化性质
• 2.1.1 吲哚美辛的理化性质
• 2.1.2 酮洛芬的理化性质
• 2.1.3 美索巴莫的理化性质
• 2.1.4 更昔洛韦的理化性质
• 2.2 模型药物体外含量测定方法
• 2.2.1 吲哚美辛体外含量测定方法
• 2.2.2 酮洛芬体外含量测定方法
• 2.2.3 美索巴莫体外含量测定方法
• 2.2.4 更昔洛韦体外含量测定方法
• 2.3 模型药物在各介质中溶解度测定
• 2.3.1 水中溶解度的测定
• 2.3.2 磷酸缓冲液中溶解度的测定
• 2.4 油水分配系数测定
• 2.5 体外经皮渗透试验方法
• 2.5.1 实验动物离体全皮和去角质皮肤的制备
• 2.5.2 微针阵列处理皮肤
• 2.5.3 供给液和接受液的配制
• 2.5.4 透皮实验操作方法
• 2.5.5 数据处理
• 2.6 微针阵列对模型药物的经皮促透作用
• 2.6.1 药物浓度对经皮渗透速率的影响
• 2.6.2 微针阵列不同预处理方式对模型药物经皮渗透速率影响
• 2.6.3 微针阵列预处理不同皮肤的药物经皮渗透特性
• 3 总结与讨论
• 参考文献
• 第三部分 微针阵列对生物大分子的体外经皮促透作用
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 2 方法与结果
• 2.1 模型药物的选择
• 2.2 药物含量测定方法的建立
• 2.2.1 MicroBCA含量测定试剂盒标准曲线的绘制
• 2.2.2 方法回收率和精密度试验
• 2.3 体外经皮渗透试验方法
• 2.3.1 实验动物离体全皮和去角质皮肤的制备
• 2.3.2 微针阵列处理皮肤
• 2.3.3 供给液配制和接受液的配制
• 2.3.4 透皮实验操作方法
• 2.3.5 数据处理
• 2.4 单因素考察
• 2.4.1 不同药物浓度对经皮渗透速率的影响
• 2.4.2 微针阵列不同预处理方式对模型药物经皮渗透速率的影响
• 2.4.3 不同针形对模型药物经皮渗透速率的影响
• 2.5 正交实验设计及结果
• 2.5.1 正交实验设计
• 2.5.2 正交实验结果
• 3 总结与讨论
• 参考文献
• 第四部分 DNA乙肝疫苗经微针皮肤给药的免疫效果评价
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 2 方法和结果
• 2.1 质粒DNA的抽提和纯化
• 2.2 皮肤刺激性评价
• 2.3 微针阵列对pVAX1的体外经皮促透作用
• 2.3.1 pVAX1的含量测定方法
• 2.3.2 实验用皮肤的制备
• 2.3.3 供给液配制和接受液的配制
• 2.3.4 透皮实验操作方法
• 2.3.5 数据处理
• 2.3.6 体外透皮实验结果
• 2.4 经微针阵列经皮给药的DNA乙肝疫苗的免疫效果
• 2.4.1 实验方法
• 2.4.2 数据分析
• 2.4.3 微针阵列药物透皮效果分析
• 2.4.4 特异性抗体分析
• 2.4.5 HBsAg-expressing CT/26细胞激发小鼠机体保护作用
• 3 总结与讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 致谢