论文摘要
前言 近几年对于细胞周期调控的研究发现,细胞可以直接感知DNA复制进程,并通过不同的检查点通路,在细胞周期各阶段发挥调控作用。细胞检查点的损伤,会增加基因组的不稳定和变异,并且与肿瘤的发生密切相关。 本课题组前期的实验已经证实,web2基因参与酿酒酵母S期检查点调控机制,并且在S期检查点调控通路上位于rad53基因上游。在rad53基因上游的重要基因有pol2、mec1、tel1和ddc2。而ddc2基因是检查点重要的传感器,其编码产物为一蛋白激酶,直接参与rad53的磷酸化,调控细胞应对DNA损伤和DNA复制阻断,而产生相应的细胞周期阻断,同时,调节特殊基因的表达,主要是参与DNA修复的基因的转录,如编码核糖核酸还原酶的rnr基因。因此选择ddc2基因作为标志,来确定web2与其的位置关系,将进一步明确web2基因在检查点控制机制中的工作位点,以便在后续工作中测定web2与其他参与检查点的基因的相互作用。 实验方法 用生物信息学手段对ddc2基因进行阅读框及其编码的氨基酸序列分析。ddc2基因碱基序列大小为2244bp,编码748个氨基酸。ddc2基因序列中没有内含子,可直接从酵母菌基因组DNA进行PCR扩增。利用提取的酵母基因组DNA为模板,通过PCR扩增ddc2基因,在扩增过程中通过引物P1、P2在ddc2基因5’端引入酶切位点BamHI,在3’引入终止密码子TAA和酶切位点EeoRI。PCR产物连接克隆载体pMD18-T形成质粒pMD18-T-ddc2并转化大肠杆菌,测序鉴定单菌落。从经测序鉴定的单菌落提取质粒,将提取的质粒与pRS316经BamHI/EcoRI双酶切、连接形成表达载体