论文摘要
背景:Neuropilin-1 （NRP1）是细胞表面相对分子量（Mr）为102,000Da的Ⅰ型跨膜糖蛋白,通过杂交瘤技术在欧洲蟾蜍的神经系统内首次被发现。进一步研究证明NRP1通常表达在内皮细胞及一些肿瘤细胞,是Semaphorin3A（Sema3A）和血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）的受体,在神经轴突的生长、血管的生成、发育和肿瘤转移中起着重要的作用[1]。最近有研究表明NRP1在原始T细胞与dendritic cell （DCs）稳定接触中起重要作用,是CD4+CD25+调节性T细胞持续的表面标志之一,不依赖于Treg细胞是否活化,在免疫反应的起始上扮演着重要角色[2]。本课题组的前期研究已显示血小板因子-4（Platelet Factor-4/PF4,又名CXCL4）可以刺激CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞的增殖[3],并与NRP1结合[4],同时在PF4刺激Treg细胞增殖过程中NRP1表达量增加[5],故推测NRP1在PF4刺激Tr增殖过程中发挥受体或共受体的作用。本研究为了进一步确定NRP1与PF4作用的结合位点或功能域,为Tr细胞的功能及其调控提供分子依据,并具有应用于治疗自身免疫性疾病的前景。方法及结果:NRP1在脊椎动物中高度保守,由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成,其中胞外段包括860个氨基酸,由3个不同的结构域组成,分别称为a1/a2、b1/b2和c。其中a1/a2又称CUB结构域（complement-binding protein homology）,b1/b2结构域与凝血因子Ⅴ和Ⅷ结构相似同源,在c结构域的中部含有MAM结构域（meprin, A5,μ）。NRP1的胞外段各个区能和不同的分子结合介导不同的信号传导,Sema3A通过a1/a2/b1区与NRP1结合,VEGF165能与NRP1的b1/b2区结合,Heparin亦通过b1/b2区与NRP1结合,所以NRP1具有多种功能[6]。根据NRP1的结构特点,本实验采用原核表达的方式分段表达NRP1的a1/a2（CUB）、b1/b2（F5/8C）、MAM三个结构域,分别得到融合蛋白后,免疫Balb/c鼠后,通过细胞融合制备单克隆抗体并对所制备抗体进行初步鉴定,鉴定后的抗体再与PF4做作用位点的筛选。首先,搜索NRP1的蛋白序列（Human Protein Reference Database, www.hprd.org）,分段截取NRP1的3个domain（CUB、F5/8C、MAM）,从人单核细胞cDNA中扩增出3个片段基因。原核表达选择pGEX-5X-1载体作为表达载体,根据载体的酶切图谱设计引物,将NRP1的3个domain基因序列分别插入到pGEX-5X-1载体的EcoR I和Not I两个限制性酶切位点之间,PCR反应后,得到目的条带;将扩增的目的片段从胶上回收后,进行T载体的连接;转化、提取质粒后双酶切,再与同时双酶切的表达载体pGEX-5X-1载体进行连接,然后再转化,各挑取两个阳性克隆,摇菌后,进行测序鉴定。将测序鉴定正确的表达载体转化入BL21菌株后诱导表达,获得正确表达的目的蛋白并纯化。其次,将纯化的GST-CUB、GST-F5/8C、GST-MAM融合蛋白与等体积福氏完全佐剂进行充分乳化,对Balb/c小鼠进行多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫一次,免疫原用量减为首免的一半,并与福氏不完全佐剂充分乳化。两周后ELISA法检测效价,效价在1:8000以上的小鼠即可进行加强免疫,加强免疫四天后进行细胞融合,ELISA法筛选能够稳定分泌抗CUB、F5/8C、MAM mAb的阳性克隆,并亚克隆,分别获得能够稳定分泌CUB单克隆抗体的细胞系6株,分泌F5/8C单克隆抗体的细胞系5株,分泌MAM单克隆抗体的细胞系2株。第三,用GST标签蛋白通过Western blot对所获单克隆抗体进行鉴定,其中不识别GST标签蛋白而只识别融合蛋白的细胞株为识别目的蛋白的阳性株。结果显示,识别CUB蛋白的阳性株:UAH058、UDC114、UDG054、UBB067、UCB064,识别F5/8C的阳性株:OCA084、OEG082,无识别MAM的阳性株。用ELISA法分别检测PF4与CUB、F5/8C的相互作用[26],结果为:PF4与F5/8C存在特异的分子间相互作用。结论:成功获得的NRP1三个片段CUB、F5/8C、MAM的鼠抗人单克隆抗体的可应用于蛋白结构、定位、功能等常规的生命科学研究外,在临床诊断和治疗方面也具有重要的意义,初步证明了PF4可与NRP1的F5/8C区发生特异性的结合,将为今后NRP1分子的功能研究奠定基础。
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