抗噻菌灵单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

论文摘要

噻菌灵属高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂,广泛应用于庄稼生产、储存过程中。它较易在土壤、水以及作物中残留,对人、畜等非靶标生物造成伤害。国内国外对蔬果中噻菌灵的残留量都十分重视。噻菌灵的常规检测方法主要是液相色谱法,但是这种检测方法存在繁琐、费时、价格昂贵等缺点。而ELISA具备简便、快速、灵敏、便宜等优点,目前国内还没有针对噻菌灵单克隆抗体及酶免疫检测方法的报道。因此,本研究的目的就是为噻菌灵残留检测提供了一种快速、灵敏检测方法。具体研究内容如下：人工抗原制备：本研究根据噻菌灵的结构特点,在其三个不同位点分别连接手臂制备了三种不同的半抗原,2-（2’-丁二酰胺基-4’-噻唑）苯并咪唑（H1）,5-琥珀酰胺基-2-（4’-噻唑）苯并咪唑（H2）,4-苯并咪唑基-2（4’-噻唑）正丁酸（H3）,核磁鉴定结果表明三种半抗原成功合成。通过活泼醋法（NHS）, H1、H2和H3分别与牛血清蛋白（BSA）偶联作为免疫原,与卵清蛋白（OVA）偶联作为包被原。通过全波长紫外扫描表明偶联成功。单克隆抗体制备：将H1-BSA、H2-BSA、H3-BSA分别免疫Balb/c小鼠,经多次免疫后小鼠尾部静脉采血测效价,各选择效价最高的小鼠进行融合。采用常规杂交瘤技术,用PEG法将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化,建立可稳定分泌抗噻菌灵的杂交瘤细胞株。结果H1筛选到1-4G9、1-6D3两株和H3筛选到3-1F9、3-5D4两株共4株能够稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株。采用间接竞争酶联免疫法（IC-ELISA）,将上述四株抗体分别与三种包被抗原组合,在12种组合中选择了一种最优异源组合：H3-OVA/1-6D3。1-6D3细胞株通过腹腔注射普通小白鼠采集腹水大量制备抗体。对1-6D3抗体进行效价、特异性测定。实验测定结果为：此株抗体稀释1600倍；与其他结构类似物交叉反应率小于0.1%。噻菌灵ELISA检测方法的建立：将H3-OVA/1-6D3异源组合运用于噻菌灵ELISA检测方法的建立,进行了工作浓度、理化因素影响、灵敏度和准确性试验。实验结果为：最佳工作浓度为H3-OVA 5 ug.mL-1,1-6D3稀释1600倍；理化因素中四种封闭物对ELISA无明显影响、最佳离子浓度为0.8mol.L-1、pH值为7.5、有机溶剂中甲醇含量在5%以内影响较小。据此建立的ELISA检测方法,以Logit（B/Bo）作纵坐标与农药浓度的对数值作横坐标建立标准曲线,检测方程为y=3.133X+3.259, R2为0.984。噻菌灵的IC10和IC5o分别为5.4μg.L-1,10.9μg.L-1。在自来水、苹果和梨的添加回收试验中,ELISA测得结果依次为95.9%-118.1%、90%-117.6%、74.9%-95.6%;HPLC测得结果依次为84.4%-109.7%、85.4%-115.8%、81.3%-121.7%。ELISA方法的测定结果与HPLC的测定结果进行相关性分析,相关系数R2达到0.96以上。实验结果表明：成功合成了三种噻菌灵半抗原；制备了抗噻菌灵的特异性强单克隆抗体；建立了噻菌灵ELISA的检测方法,并成功运用于自来水、苹果、梨的添加回收。这不仅达到了实验的目的—为噻菌灵残留检测提供了一种快速、灵敏检测方法,也为农药残留检测试剂盒的开发提供了基础,为环境安全检测提供了重要的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 农药残留速测研究的重要性
• 1 农药残留的现状及危害
• 1.1 农药残留的现状
• 1.2 农药残留问题的主要危害
• 1.3 农药残留的主要方面
• 1.4 开展农药残留速测技术研究的意义
• 1.5 我国农药残留控制措施的研究进展
• 2 农药残留分析技术的发展动态
• 2.1 仪器分析方法
• 2.2 生物学分析方法
• 2.3 免疫分析方法
• 3 苯并咪唑类农药残留检测研究
• 3.1 苯并咪唑类农药残留现状
• 3.2 苯并咪唑类农药残留分析
• 4 农药残留检测技术发展方向
• 4.1 完善快速检测技术
• 4.2 突破在线检测技术
• 4.3 提高测定复杂样品的能力
• 第二章 酶免疫检测技术在农药残留分析中的应用
• 1 农药残留免疫分析技术
• 1.1 农药残留酶免疫分析技术特点
• 1.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA）原理及分类
• 2 农药小分子的残留免疫分析
• 2.1 半抗原的制备
• 2.2 人工抗原的合成与优选
• 2.3 人工抗原的纯化、鉴定
• 3 农药等小分子抗体制备技术研究进展
• 3.1 多克隆抗体的制备
• 3.2 单克隆抗体的制备
• 3.3 基因重组抗体的制备
• 研究内容
• 第一章 噻菌灵农药三种半抗原的合成与鉴定
• 1 实验部分
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 半抗原结构鉴定
• 2.2 人工抗原偶联鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于半抗原的设计
• 3.2 关于抗原的合成与鉴定
• 第二章 噻菌灵单克隆抗体制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠血清效价测定
• 2.2 单克隆抗体的大量制备
• 2.3 单克隆抗体的特异性分析
• 3 讨论
• 3.1 单克隆抗体制备过程中的几个重要环节
• 3.2 关于单克隆抗体的大量制备
• 第三章 噻菌灵间接竞争ELISA方法的建立
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 噻菌灵间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 抗原抗体组合筛选
• 2.2 最佳工作浓度
• 2.3 理化因素对ELISA的影响
• 2.4 ELISA标准曲线的建立
• 2.5 准确度测定及HPLC方法验证
• 3 讨论
• 3.1 关于ELISA检测灵敏度分析
• 3.2 关于间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 3.3 ELISA与HPLC检测方法比较分析
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 致谢