家蚕气味结合蛋白基因时空表达的研究

论文摘要

气味结合蛋白（OBP）与气味信息物质发生作用,是昆虫产生嗅觉及觅食、求偶等行为反应的第一步,具有特殊的作用和意义。家蚕的嗅觉灵敏,是研究昆虫化学通讯的理想模型。近年来,国内外对家蚕嗅觉相关蛋白质,如化学感受蛋白、气味受体等进行了广泛的研究,但是对家蚕OBP的时空表达缺乏系统研究。探明OBP的表达规律不仅可进一步阐明家蚕行为反应的本质,为控制害虫、开发家蚕饲养新技术提供理论依据,而且对于研究动物的嗅觉识别机制具有重要的启示作用。为此,本论文利用半定量RT-PCR等方法,从mRNA转录水平上测定家蚕不同发育阶段、不同组织器官及不同食性蚕品种的7种obp基因（gobp1、gobp2、abp、abpx、pbp1、pbp2、pbp3）表达的差异。主要结果如下:⑴在家蚕幼虫期各组织器官中只检测到ABP和ABPX两种obp基因的表达,其它5种obp基因在mRNA转录水平上则没有检测到任何表达。但在家蚕成虫期7种obp基因均有不同程度表达。幼虫与成虫obp基因表达的差异,可能与其嗅觉感受谱和嗅敏度不同有一定关系。⑵检测了幼虫头部三个不同的发育时期ABP和ABPX基因表达。发现5龄取食期和熟蚕期的相对表达量高于4龄眠期。这可能与眠期嗅敏度下降有一定关系。⑶通过摘除触角、下颚须等方法探讨了幼虫头部嗅觉器官obp基因的表达情况。结果表明,5龄取食期ABP基因和ABPX基因及熟蚕期ABPX基因的相对表达量因摘除触角或下颚须而显著下降,而在4龄眠期摘除则对表达量无显著影响。这说明幼虫期obp基因不仅在具有嗅觉感器的触角和下颚须中表达,而且也在头部其他部位表达。⑷ABP和ABPX基因不仅在具有嗅觉器的头部表达,在幼虫的胸足、腹足、丝腺、中肠、脂肪体、马氏管等非嗅觉器官中也普遍存在高表达。⑸对人工饲料和非桑植物摄食性不同的广食、C108和丰一3个蚕品种,幼虫期头部ABP和ABPX基因的相对表达量均是C108最低,而其食性为中等水平。说明食性的广、狭与obp基因表达量并无直接关系。⑹蛹和成虫触角中7种obp基因均有表达,但不同发育时期的表达存在差异。羽化前5天雌蛹GOBP2基因以及雌雄蛹的PBP2和PBP3基因没有表达,PBP1基因的表达量也很少。其余基因在从羽化前5天的蛹到羽化后4天的成虫均有表达,其中GOBP基因和PBP基因以羽化前1天及羽化当天的表达量较高,而ABP基因各时期的表达量差别较小。雌雄之间7种obp基因在不同时期的相对表达量多数不存在显著差异。⑺测定了羽化前1天雌雄蚕蛹（潜成虫）的触角、胸足和翅中7种obp基因的表达情况。发现各种基因在触角中全部表达而且相对表达量最高,其次是胸足,翅中的相对表达量最低。其中2种GOBP基因及PBP2和PBP3基因在翅中无表达。雌雄间的相对表达量多无显著差异。⑻测定了羽化当天雌雄成虫的触角、去触角头部、胸足、翅、体壁、腹末端（含外生殖器）及脂肪体等组织器官中7种obp基因的表达的差异。发现所有基因在触角中均有表达,而且相对表达量最高,雄性的表达量不同程度高于雌性。GOBP1、ABP和PBP1三个基因在所有测定的器官组织中均有表达,其余4种基因则在有些组织器官中不表达。与羽化前1天obp基因的表达情况存在一定差异。⑼测定了广食、C108和丰一品种成虫触角中obp基因表达的差异。结果表明,GOBP基因、ABP基因及PBP1基因的相对表达量品种之间及雌雄之间差异较小,但PBP2和PBP3基因的相对表达量均是广食和C108显著高于丰一。⑽试验发现,ABP基因在所测定的各个发育阶段、所有组织器官及蚕品种中均有较高表达,无时间特异性和组织特异性,很可能ABP基因还具有其他功能。关于obp基因表达与嗅觉反应、行为及食性的关系,各种OBP的具体功能等还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 信息化合物对昆虫行为的作用
• 1.2 昆虫对化学信息的感受机制
• 1.2.1 昆虫（家蚕）的嗅觉生理
• 1.2.2 昆虫（家蚕）的味觉生理
• 1.3 昆虫气味结合蛋白的研究进展
• 1.3.1 气味结合蛋白的种类
• 1.3.2 气味结合蛋白的生化特性
• 1.3.3 气味结合蛋白的表达及分布
• 1.3.4 气味结合蛋白的研究方法
• 1.3.5 气味结合蛋白的生理功能
• 1.3.6 气味结合蛋白与气味分子作用的机制
• 1.4 昆虫化学感受蛋白及气味受体
• 1.4.1 化学感受蛋白
• 1.4.2 气味受体
• 1.5 半定量RT-PCR 技术简介
• 1.5.1 半定量RT-PCR 技术原理
• 1.5.2 半定量RT-PCR 技术的关键因素
• 1.5.3 半定量RT-PCR 技术的优点
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 主要试剂、缓冲液
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 家蚕组织总RNA 的抽提
• 2.2.3 cDNA 的合成
• 2.2.4 半定量RT-PCR 反应体系及条件设置
• 2.2.4.1 退火温度的确定
• 2.2.4.2 循环数的确定
• 2.2.4.3 RT-PCR 反应体系
• 2.2.4.4 电泳图片的获得
• 2.2.4.5 A3 及obp 基因表达量的定量分析
• 3 结果与分析
• 3.1 半定量RT-PCR 反应条件的确立
• 3.1.1 RNA 提取效果的鉴定
• 3.1.2 引物设计和退火温度的确定
• 3.1.3 循环数的确定
• 3.2 家蚕幼虫期obp基因表达分析
• 3.2.1 不同发育期头部器官obp基因表达的差异
• 3.2.2 5龄中期不同组织器官obp基因表达的差异
• 3.2.3 家蚕不同品种5 龄中期全头部obp 基因表达的差异
• 3.3 家蚕蛹期和成虫期obp 基因表达分析
• 3.3.1 羽化前一天（潜成虫）不同器官obp基因表达的差异
• 3.3.2 成虫羽化当天不同组织器官obp 基因表达的差异
• 3.3.3 蛹和成虫不同时期触角中obp 基因表达的差异
• 3.3.4 家蚕不同品种成虫期触角中obp 基因表达的差异
• 4 讨论
• 4.1 家蚕幼虫期obp基因的时空表达
• 4.1.1 幼虫期obp基因表达与发育时期的关系
• 4.1.2 幼虫期obp 基因表达的组织特异性
• 4.1.3 不同蚕品种幼虫期obp基因表达的差异
• 4.2 家蚕蛹期和成虫期obp 基因的时空表达
• 4.2.1 蛹期和成虫期obp基因表达的时间特异性
• 4.2.2 成虫期obp基因表达的组织特异性
• 4.2.3 不同蚕品种成虫期obp基因表达的差异
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间公开发表的论文