蜜蜂球囊菌cDNA文库的构建及胞外酶的定性研究

论文摘要

蜜蜂白垩病（bee chalkbrood disease）是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的真菌性传染病,主要感染蜜蜂幼虫。白垩病是我国养蜂业中潜在病害之一,影响着我国养蜂业的发展。目前国内外对蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物学特性、最适培养条件、发病流行规律、病理学、病情的诊断等方面,由于蜜蜂球囊菌的致病机理不明,不能在生产中有效的预防和治疗蜜蜂白垩病。我们采用Stratagene公司的ZAP Eepress（?）cDNA Synthesis Kit and ZAP Express（?）cDNA Gigapack（?）ⅢGold Cloning Kit试剂盒,构建了蜜蜂球囊菌cDNA文库。文库滴度测定为106pfu·mL-1,扩增后的滴度是109pfu·mL-1;噬菌体的转化后,蓝白斑筛选单菌落,重组率达到90%。这为后续工作的进行打下良好的基础。昆虫中肠围食膜主要由蛋白质、几丁质和糖类等组成。蜜蜂球囊菌通过分泌胞外蛋白酶、几丁质酶、酯酶和淀粉酶等破坏蜜蜂幼虫中肠围食膜侵染蜜蜂;本试验对几种常见的蛋白酶、酯酶和淀粉酶分别进行活性染色和银染,结果显示:蜜蜂球囊菌能够胞外分泌蛋白酶、酯酶和淀粉酶。在SDS-PAGE条件下,蛋白酶活性染色有两条条带,分子量为37.0 kDa和110.0 kDa;酯酶活性染色鉴定出三条带,分子量是14.1 kDa、20.1 kDa、29.0 kDa。在PAGE条件下,蛋白酶有两条条带,分子量为48.0 kDa和94.0 kDa;酯酶活性鉴定出一条带,分子量是35.0kDa淀粉酶活性鉴定出至少三条带,分子量为90.0 kDa、97.2 kDa和大于97.2 kDa。此外,我们还对球囊菌分泌几丁质酶的情况进行了探索。利用蜜蜂球囊菌胞外分泌物（几丁质结合蛋白）结合胶体几丁质（N-乙酰葡糖氨）,设计不同结合时间、不同缓冲体系,进行结合蛋白试验,然后结合后进行Loading buffer和Calcofluor（M2R）处理;pH 7.4条件下结合6 d,Loading buffer处理的效果好,同时得出Loading buffer比Calcofluor（M2R）处理效果好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 蜜蜂白垩病研究进展
• 1.1 病原学研究进展
• 1.2 培养条件的研究
• 1.3 流行病学的研究进展
• 1.3.1 病情诊断
• 1.3.2 发病规律的研究
• 1.3.3 疾病的传播
• 1.4 白垩病预防与疾病防治研究进展
• 1.4.1 加强蜜蜂检疫
• 1.4.2 加强饲养管理
• 1.4.3 抗病育种
• 1.4.4 药物治疗方面的研究
• 2 昆虫围食膜（PM）的研究进展
• 2.1 PM的发现
• 2.2 PM的形成
• 2.3 PM的组成成分
• 2.3.1 几丁质
• 2.3.2 PM蛋白成分
• 2.4 PM的结构
• 2.5 PM的功能
• 2.5.1 物理保护和外源物入侵的屏障
• 2.5.2 化学保护PM
• 2.5.3 选择性通透性
• 2.5.4 中肠腔的区室化用
• 3 研究目的与意义
• 第二部分 蜜蜂球囊菌cDNA文库的构建
• 1 试验材料
• 1.1 试验菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液配制
• 2 试验方法与步骤
• 2.1 菌种的培养
• 2.1.1 马铃薯酵母培养基（PDA）的配制
• 2.1.2 菌株的培养和纯化
• 2.2 蜜蜂球囊菌总RNA的提取
• 2.3 mRNA试剂盒的分离纯化
• 2.3.1 准备工作
• 2.3.2 分离纯化
• 2.4 cDNA文库的构建
• 2.4.1 cDNA第一链的合成
• 2.4.2 cDNA第二链的合成
• 2.4.3 cDNA末端钝化
• 2.4.4 连接EcoR I接头
• 2.4.5 EcoR I末端磷酸化
• 2.4.6 Xho I消化
• 2.4.7 cDNA不同大小片段的分离
• 2.4.8 文库的包装
• 2.4.9 文库滴度测定
• 2.5 文库的体外切割
• 2.6 小量质粒提取
• 2.7 PCR方法鉴定插入片断大小
• 3 结果
• 3.1 蜜蜂球囊菌的总RNA质量鉴定与cDNA定量
• 3.2 cDNA文库的分级分离
• 3.3 cDNA文库滴度
• 3.4 质粒及PCR检测结果
• 4 小结
• 第三部分 蜜蜂球囊菌胞外酶的定性研究
• 1 试验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂与配制
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 试剂配制
• 1.2.3 仪器
• 2 试验方法
• 2.1 菌种的培养
• 2.1.1 马铃薯酵母培养基的配制
• 2.1.2 液体合成培养基配制
• 2.1.3 菌株的培养和纯化
• 2.2 粗酶液的制备与浓缩
• 2.2.1 粗酶液的制备
• 2.2.2 粗酶液的浓缩
• 2.3 胶体几丁质制备
• 2.4 SDS-PAGE和PAGE配制
• 2.4.1 分离胶的配制步骤
• 2.4.2 浓缩胶的配制步骤
• 2.5 蛋白浓度的测定
• 2.6 胞外酶的鉴定
• 2.6.1 蛋白酶染色
• 2.6.2 酯酶活性染色
• 2.6.3 淀粉酶活性染色
• 2.7 结合试验步骤
• 2.8 银染色步骤
• 2.9 考马斯亮蓝染色步骤
• 3 结果
• 3.1 蛋白浓度测定
• 3.2 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶、酯酶和淀粉酶的鉴定
• 3.2.1 蜜蜂球囊菌的胞外分泌物
• 3.2.2 蜜蜂球囊菌的菌体
• 3.3 凡丁质结合蛋白实验
• 3.3.1 Loading buffer处理样品
• 3.3.2 荧光增白剂CalcofluorM2R处理样品
• 4 小结
• 第四部分 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录