小鼠肠道菌群及肺炎克雷伯菌对氟喹诺酮类药物的耐药性研究

论文摘要

背景及目的近年来,以大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.Coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,Kpn）为代表的肠杆菌科细菌对氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones,FQS）耐药现象日趋严重。研究大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯杆菌对FQS耐药机制,对控制耐药性的产生和发展,合理应用抗菌药物具有重要意义。为此,本文就这两种细菌耐药性的获得进行了部分抗菌药物的体外实验研究,并对诱导成功的肺炎克雷伯菌耐药基因gyrA和parC进行PCR扩增和部分耐药菌株DNA测序。动物实验模拟临床用药方式,观察加替沙星正规用药和非正规用药方式对小鼠肠道菌群的影响方法动物实验采用24只清洁级昆明小鼠,随机分为3组,每组8只,对照组只灌胃生理盐水,另外两组按正规用药和非正规用药给小鼠灌胃加替沙星溶液,7天后无菌采取小鼠粪便培养,观察各组小鼠粪便中双歧杆菌,类杆菌,乳酸杆菌,大肠杆菌及肠球菌数量。同时直接涂片做革兰氏染色查菌。用表型确认法对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌鉴定到种。用确证试验对119株大肠埃希菌和73株肺炎克雷伯菌做ESBLs检测,K-B法做药敏试验。然后用琼脂二倍稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星对两种细菌的最小抑菌浓度。依据细菌鉴定及MIC结果最终选择15株大肠埃希菌和10株肺炎克雷伯菌作为实验菌株,分别编入环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星诱导实验组。同时用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株。对实验菌株进行体外多步法诱导性耐药试验。具体步骤如下①将试验菌株接种于麦康凯平板,18h～24h培养后,取纯菌落2～3个用灭菌生理盐水先配成0.5个麦氏单位,再稀释成107CFU/ml。取10μl的菌悬液接种于2ml含1/4 MIC抗菌药物浓度的MH肉汤中,使其最终细菌接种量为5×104CFU/ml。②35℃培养24h,如果有细菌生长,用24h的细菌培养物用灭菌生理盐水稀释制备1×107CFU/ml的菌悬液,取10μl的菌悬液接种于2ml含1/2MIC抗菌药物浓度的MH肉汤中,35℃培养24h。③同上步骤,将细菌接种于含抗菌药物浓度逐步增高的MH肉汤中培养,如有细菌生长,直至含抗菌药物浓度128μg/ml,将诱导的耐药菌株接种在不含抗菌药物的MH肉汤中35℃培养,每24h转种一次,连续传代5次。然后转入含抗菌药物浓度128μg/ml的肉汤,最后转种于麦康凯平板看有无细菌生长。革兰氏染色及生化实验重新鉴定菌株。从麦康凯平板挑取典型菌落用琼脂二倍稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星对这两种菌的MIC。用PCR扩增诱导菌株耐药基因gyrA和parC并对其进行测序分析。结果动物实验加替沙星灌胃7天后小鼠肠道菌群失调,与给药前相比,大肠埃希菌和肠球菌药敏结果无明显变化。灌胃前后大肠埃希菌对CIP、LEV、GAT、AM、CRO、AMK、NOR较敏感,肠球菌对AM、LEV、VA、GAT较敏感,对NOR、CIP、CRO敏感性不同。两种用药方式可导致大肠埃希菌数量显著减少（P＜0.05）,肠球菌数量稍有增加（P＞0.05）。而双歧杆菌,乳酸杆菌和类杆菌数量无明显变化（P＞0.05）。119株大肠埃希菌检出产ESBLs 54株,阳性率45.4%。73株肺炎克雷伯菌检出产ESBLs 36株,阳性率49.3%。产ESBLs菌株对抗生素的耐药率显著高于非产ESBLs菌株。本实验环丙沙星诱导组中10株E.coli为敏感菌株（MIC≤1μg/ml）,2株E.coli为中介耐药菌株（MIC=2μg/ml）,3株E.coli为耐药菌株（MIC≥4μg/ml）,这15株E.coli经环丙沙星诱导成13株高耐环丙沙星菌株（MIC≥128μg/ml）。左氧氟沙星诱导组和加替沙星诱导组中有10株E.coli为敏感菌株（MIC≤2μg/ml）,3株E.coli为中介菌株（MIC=4μg/ml）,2株E.coli为耐药菌株（MIC≥18μg/ml）,15株E.coli经左氧氟沙星和加替沙星分别诱导成8株和5株高度菌株（MIC≥128μg/ml）。每组10株Kpn经环丙沙星诱导成8株高耐环丙沙星菌株。经左氧氟沙星诱导成7株高耐左氧氟沙星菌株。经加替沙星诱导成4株高耐加替沙星菌株。六组细菌诱导后MIC均达到128μg/ml以上,MIC值比诱导前增加16-16410倍。经一种药物诱导耐药后对另外两种药物MIC也增加8-8205倍。此结果证明了大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是逐步耐药的进程。本研究DNA序列显示8株Kpn中的gyrA基因均有突变,第83位氨基酸的密码子发生了（TCC→ATC/TTC/TAC）的突变,引起了相应氨基酸的改变（Ser-83→Ile/Phe/Tyr）。其中有4株同时出现了第87位点（GAC→GAA/GCC）的改变,氨基酸也由Asp-87→Glu/Ala。有5株parC出现了第80位氨基酸密码子点突变（AGC→ATC）,引起氨基酸由Ser→Ile的改变。而这5株同时有gyrA变异,这说明gyrA变异合并有parC变异,其对FQS的耐药性会增强。在本研究中只发现parC变异有丝氨酸Ser80（AGC）→异亮氨酸Ile（ATC）,未发现其他变异。结论1.动物实验表明加替沙星两种用药方式短时期（7天）使用对肠道菌群影响不大,加替沙星不易产生耐药性。2.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌通过长期不断地接受抗菌药物的压力和选择,体外诱导菌株可获得高度耐药性。3.gyrA和parc基因突变是肺炎克雷杆菌对氟喹诺酮药物产生耐药的主要原因。诱导耐药菌株中普遍存在着gyrA的变异,其中以第83位氨基酸Ser83的变异多见。gyrA变异合并有parC变异时,其耐药性增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文 小鼠肠道菌群及肺炎克雷伯菌对氟喹诺酮类药物的耐药性研究
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对氟喹诺酮类药物耐药性研究
• 文献综述
• 参考文献
• 英文缩略词
• 附录实验照片
• 在读研期间发表论文
• 致谢