新的细胞外钙感受机制在缺氧引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度变化中的作用

论文摘要

第一部分钙敏感受体在肺动脉血管平滑肌上表达及功能目的：（1）探讨钙敏感受体在肺动脉平滑肌组织与细胞上的表达、分布。（2）探讨钙敏感受体在高钙诱导肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度变化中的作用。方法：用组织贴块法原代培养大鼠肺动脉血管平滑肌细胞，用胰蛋白酶消化法进行细胞传代培养。用钙敏感受体特异性单克隆抗体，采用免疫印迹、组织与细胞化学免疫荧光技术检测钙敏感受体在大鼠肺动脉血管平滑肌组织与细胞上的表达与分布。采用钙荧光探针Fura-2／AM和显微荧光成像系统检测胞浆钙离子浓度。结果：（1）细胞的形态与平滑肌肌动蛋白α的特异性表达证实所培养的细胞为大鼠肺动脉平滑肌细胞。（2）特异性抗体检测发现肺动脉血管平滑肌组织和细胞均有钙敏感受体的表达，细胞膜与细胞浆均见其分布，且分子量不同，分别为55-72kD和170kD左右。（3）6 mM和7.5 mM[Ca2+]0分别使肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度从76.53±2.23 nM快速上升至238.78±7.26和382.74±9.87 nM（p＜0.01，N=23），并维持在高位水平，形成一高平台，细胞外液恢复到常钙时，胞浆钙离子浓度先迅速下降，然后缓慢下降，并形成一略高于基线的平台；而4 mM[Ca2+]0引起胞浆钙离子浓度的变化与基线水平无显著差异（p＞0.05，N=23）。（4）钙敏感受体抑制剂Calhex 231 1μM+6 mM或7.5 mM[Ca2+]0使肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度从75.54±6.48 nM分别上升至139.26±11.25 nM和198.89±18.39 nM（p＜0.01，N=21）；3μM Calhex 231+6mM或7.5 mM Ca2+使胞浆钙离子浓度从77.91±3.65 nM上升至99.15±6.18 nM和119.07±10.63 nM（p＜0.01，N=20）；而0.1μM Calhex 231对6 mM和7.5 mM[Ca2+]0所致钙离子浓度变化无显著影响（p＞0.05，N=23）。结论：（1）肺动脉血管平滑肌组织与细胞均有对胞外钙敏感的受体，细胞膜与细胞浆均见其分布。（2）钙敏感受体抑制剂Calhex 231显著抑制胞外高钙所致肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度的升高，表明钙敏感受体参与了细胞外高钙引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度的升高。第二部分新的细胞外钙感受机制在缺氧引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度变化中的作用目的：（1）证实缺氧对肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度及活性氧的变化。（2）探讨钙敏感受体在缺氧触发肺动脉平滑肌细胞钙信号变化中的作用。（3）确定缺氧时肺动脉平滑肌细胞活性氧变化与钙敏感受体活化，胞浆钙离子浓度变化之间的关系。方法：向灌流液中充入氮气复制细胞缺氧模型，采用钙荧光探针Fura-2／AM、活性氧敏感探针H2-DCFDA和显微荧光成像系统检测胞浆钙离子浓度及活性氧含量的变化。运用RNAi技术特异性抑制CaR基因的表达，采用免疫印迹技术检测干扰效率。结果：（1）肺动脉平滑肌细胞经三次间断的低氧处理，胞浆钙离子浓度从77.66±1.74 nM分别上升到161.13±11.25 nM、133.03±8.44 nM、109.94±4.64 nM，均显著高于基线水平（p＜0.01，N=51），且后一次缺氧产生的钙离子浓度峰值均明显小于前一次（p＜0.01）。（2）用低氧无钙液灌流肺动脉平滑肌细胞，胞浆钙离子浓度下降至69.65±3.59 nM，略低于基线水平（78.09±2 nM，N=43），无统计学差异（p＞0.05），但与有胞外钙的单纯缺氧组（133.03±8.44 nM，N=51）相比，显著降低（p＜0.01）。（3）实验分为Blankcontrol、ShRNA control和ShRNA targeted三组，其[Ca2+]i基线水平分别为80.67±3.49nM（N=14）、79.3±4.17 nM（N=11）和80.53±4.3 nM（N=9），各组之间无显著差异（p＞0.05）。缺氧使ShRNA targeted组肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i上升至109.16±8.41 nM，比Blank control组（148.22±8.89 nM）和ShRNA control组（150.68±10.48 nM）显著降低（p＜0.01）。100μM组胺刺激Blank control、ShRNA control及ShRNA targeted组肺动脉平滑肌细胞，使[Ca2+]i分别上升为222.21±15.33 nM、223.12±16.85 nM、224.48±18.76nM，各组之间无显著差异（p＞0.05）。（4）缺氧（PO2为14.3±2.5 mmHg）使肺动脉平滑肌细胞内活性氧荧光绝对值从824.44±26.43上升到2590.66±97.37，平均升高至常氧的3.14±0.13倍（p＜0.01，N=22），活性氧荧光值变化率[（处理后荧光值-处理前荧光值）／处理前荧光值×100％]为（214.23±10.58）％。（5）细胞外分别加入0.1、1、10、20、30、50和100μM H2O2模拟缺氧所致肺动脉平滑肌细胞活性氧的变化，得到一回归曲线：y=0.064x+1.9023，R2=0.9897[其中x为活性氧荧光值变化率（％），y为过氧化氢浓度（μM）]，并计算出上述缺氧模型所致肺动脉平滑肌细胞活性氧浓度为（15.61±1.24）μM（N=22）。（6）用15.61μM H2O2处理Blank control、ShRNA control和ShRNA targeted三组肺动脉平滑肌细胞3分钟，其[Ca2+]i分别上升至151.27±9.7nM（N=12）、149.83±10.05 nM（N=8）、105.7±7.83 nM（N=7），其中ShRNA targeted组比Blank control和ShRNA control显著降低（p＜0.01）。各组之间基线[Ca2+]i及100μM组胺所致的[Ca2+]i峰值无显著差异（p＞0.05）。结论：缺氧通过增加活性氧来活化CaR使其敏感性增高，在细胞外常钙作用下被激活，引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度升高。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 钙敏感受体在大鼠肺动脉平滑肌上的表达及功能
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 新的细胞外钙感受机制在缺氧引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙离子浓度变化中的作用
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢