论文摘要
目的将KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因载入慢病毒颗粒,探讨目的基因过表达慢病毒颗粒感染人心肌成纤维细胞使之重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell ,iPSC）的关键技术。方法采用直接贴壁法分离培养出人心肌成纤维细胞（Human cardiac fibroblasts ,HCFs）,取孕13.5～14.5d昆明胎鼠,采用胰蛋白酶消化法分离培养出小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEFs）;分别在倒置显微镜观察细胞生长情况,以台盼蓝染色、免疫细胞化学染色检测细胞活力及鉴定。采用丝裂霉素-C（Mitomycin C ,MMC）处理胚胎成纤维细胞制备饲养层细胞。分别构建和包装含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因过表达的慢病毒颗粒、含绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的慢病毒颗粒。将表达绿色荧光蛋白的慢病毒颗粒感染人心肌成纤维细胞,在荧光倒置显微镜下观察感染效率及荧光表达情况,筛选最佳感染条件及感染复数（Multiplicity of infection,MOI值）;将含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因过表达的慢病毒颗粒感染人心肌成纤维细胞,在倒置显微镜下观察形态变化,筛选最佳实验室条件。结果采用组织块直接贴壁法多次、同时贴壁多个组织块可获得足量的HCFs,其杂细胞少,活力佳,细胞呈长梭形,无自发性搏动。选取孕13.5～14.5d胎鼠,采用0.0625%胰蛋白酶低浓度分段消化,可获取稳定、足量、高活力的MEFs,传至3代后MEFs纯化,用丝裂霉素-C处理可满足滋养层制备的要求。分别成功构建含绿色荧光蛋白及目的基因过表达的慢病毒颗粒,并成功感染人心肌成纤维细胞,后者可使人心肌成纤维细胞发生明显形态变化。结论本研究证实慢病毒颗粒可成功感染人心肌成纤维细胞,特定基因转导可诱导细胞形态变化。
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标签：慢病毒论文; 诱导性多能干细胞论文; 人心肌成纤维细胞论文; 小鼠胚胎成纤维细胞论文;