泛素-26S蛋白酶体途径对寄主和非寄主抗性的调控功能分析

论文摘要

泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白,因广泛存在于各种真核生物细胞中而得名。泛素化是一种蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTM）,与蛋白质磷酸化信号传导作用相似,其在细胞生命活动的许多进程中发挥着至关重要的作用,比如涉及内吞作用、组蛋白活性和DNA修复等过程。泛素化的蛋白通过26S蛋白酶体进行降解。泛素-26S蛋白酶体途径是植物中高效专一蛋白降解调控机制之一,几乎参与植物生命活动的各个环节。越来越多的研究发现泛素化系统与人类疾病密切相关,但是关于植物泛素化蛋白与植物抗病性的研究较少。本研究利用VIGS技术分析了2个泛素-26S蛋白酶体途径相关基因在植物抗病中的作用,同时运用蛋白质组学技术,研究了本氏烟对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）非寄主抗性表现与不表现时的蛋白差异表达情况,鉴定了表现该非寄主抗性时的泛素化蛋白。获得了以下结果：（1）采用VIGS技术分析了泛素融合降解蛋白（ubiquitin fusion protein,18-8）基因对植物抗病和抗逆性的调控功能。发现18-8沉默植株产生的Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导产生的过敏性反应（hypersensitive response, HR）症状比对照显著减轻。18-8沉默植株产生的水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）诱导的HR症状也比对照显著减轻。在沉默植株叶片上接种烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci, Pst）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum, Ss）后推迟产生并表现更轻的病害症状。高盐胁迫下,18-8沉默植株的叶片的叶绿素降解比对照明显增强。这些研究结果表明,18-8基因是植物抗病和抗逆性重要调控因子。它可能对Xoo介导的HR和耐盐性起正向调控作用,而对Pst和Ss的抗病性起负调控作用。（2）通过VIGS技术研究了泛素羧端水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase,18-5）的基因功能,研究发现80%沉默植株与CK产生了一样强烈的Cf介导的HR反应。18-5沉默植株产生更弱的Xoo诱导的HR和更早更强的干旱萎蔫症状。Ss对沉默植株的侵染情况与CK相似。高盐胁迫下,18-5沉默植株的叶片的叶绿素降解比对照明显增强。。这些研究结果表明,18-5可能参与水稻白叶枯病菌介导的非寄主抗性、耐盐、抗旱等调控。（3）开展了本氏烟对Xoo的非寄主抗性蛋白质组学分析。通过双向电泳分析,分别获取了MG132处理和MG132+Xoo处理的烟草叶片组织蛋白质图谱。两种处理的蛋白质图谱的比较分析表明,蛋白质丰度变化在2倍以上的差异蛋白点有45个,通过MALDI-TOF-TOF-MS质谱分析成功鉴定了其中36个。其中8/9（32个）在MG132+Xoo处理中表达下调,1/9（4个）表达上调。这些差异表达蛋白主要涉及代谢（25%）、光合作用（25%）、生物合成（氨基酸合成10%、蛋白合成3%和维生素合成3%）、防卫相关蛋白（12%）、蛋白降解（5%）、细胞骨架（2%）、转录调节（2%）、信号传导（5%）、细胞运动（2%）、核质运输（2%）、转录后的基因表达调控（2%）,另外有2%蛋白功能未知。（4）采用免疫亲和色谱以及色质联用技术进行了表现Xoo诱导的非寄主抗性时的本氏烟植株中的泛素化蛋白。利用泛素抗体柱,通过亲和色谱富集和纯化泛素化蛋白,然后采用液向色谱与纳升级质联用技术,鉴定了MG132+Xoo处理的烟草叶片组织中的泛素化蛋白。在初步分析中已成功检测到10个可信度在90%以上的泛素化蛋白。包括RNAi核心调控蛋白OsAGO1、醛-酮还原酶家族蛋白、ATP合酶、2个未知蛋白。其中6个蛋白与双向电泳结果吻合,说明该结果的可信度较高。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 文献综述:泛素-26S蛋白酶体途径及其对植物抗病性的调控作用研究进展
• 1 泛素及蛋白泛素化
• 1.1 泛素
• 1.2 泛素样蛋白
• 1.3 蛋白泛素化
• 1.3.1 泛素化
• 1.3.2 单泛素化与多泛素化
• 2 泛素-26S蛋白酶体途径
• 2.1 泛素-26S蛋白酶体体系组成
• 2.1.1 去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes,DUB）
• 2.1.1.1 泛素特异性修饰酶（ubiquitin specific processing enzymes,UBPs/USPs）
• 2.1.1.2 泛素羧基水解酶家族（ubiquitin carboxy-terminal hydrolases,UCH）
• 2.1.2 泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme,E1）
• 2.1.3. 泛素结合酶（ubqu itin2con juga tingenzyme,E2）
• 2.1.4 泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligating enzyme,E3）
• 2.1.5 26S蛋白酶体
• 2.2 泛素-26S蛋白酶体途径作用机制
• 3. 泛素/265蛋白酶体系统的抗病调控功能
• 3.1 泛素化在植物防卫反应中的作用
• 3.2 E酶系介导的抗病调控功能
• 3.3 26S蛋白酶体的抗病调控功能
• 4. 泛素/26S蛋白酶体系统在植物病害发生中的作用
• 5 本研究的目的意义和主要研究内容
• 第一章 泛素-26S蛋白酶途径相关基因—18-8基因和18-5基因对植物抗性的调控功能分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 载体、菌株以及实验试剂
• 2.3 VIGS分析基因功能
• 2.3.1 VIGS操作流程
• 2.3.2 基因沉默植株的表型分析
• 2.3.2.1 Xoo介导的HR检测
• 2.3.2.2 Ss抗性检测
• 2.3.2.3 烟草野火病菌（Pst）接种处理
• 2.3.2.4 耐/抗盐胁迫检测
• 3 结果和分析
• 3.1 本氏烟VIGS处理
• 3.2 18-8基因的功能分析
• 3.2.1 18-8基因对Cf介导的过敏性反应的调控作用
• 3.2.2 18-8基因对Xoo介导的HR的调控作用
• 3.2.3 18-8基因对抗油菜菌核病菌（Ss）的调控作用
• 3.2.4 18-8基因对烟草野火病菌（Pst）的调控作用
• 3.2.5 18-8基因对逆境胁迫的调控作用
• 3.2.5.1 18-8基因对高盐胁迫的调控作用
• 3.2.5.2 18-8基因对干旱胁迫的调控作用
• 3.3 18-5基因的功能分析
• 3.3.1 18-5基因对Cf介导的过敏性反应的调控作用
• 3.3.2 18-5基因对Xoo介导的HR的调控作用
• 3.3.3 18-5基因对抗油菜菌核病菌（Ss）的调控作用
• 3.3.4 18-8基因对烟草野火病菌（Pst）的调控作用
• 3.3.5 18-5基因对干旱胁迫和高盐胁迫的调控作用
• 4 讨论
• 4.1 18-8和18-5在本氏烟抗病中的作用
• 4.2 18-8和18-5在本氏烟抗逆中的作用
• 第二章 本氏烟与稻白叶枯菌的非寄主抗性蛋白质组学分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 MG132处理植株
• 2.1.2 病原菌的接种
• 2.2 主要实验仪器和试剂
• 2.3 双向凝胶电泳
• 2.3.1 样品制备
• 2.3.2 蛋白定量
• 2.3.3 第一向等电聚焦
• 2.3.4 胶条平衡
• 2.3.5 SDS-PAGE
• 2.3.6 染色
• 2.3.7 图像采集与分析
• 2.3.8 染色蛋白质的质谱鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 本氏烟叶片组织的取样
• 3.2 本氏烟叶片组织蛋白定量测定结果
• 3.3 双向电泳分析结果
• 4 讨论
• 4.1 氧化还原调节
• 4.2 信号传导
• 4.3 其他
• 第三章 稻白叶枯病菌浸润处理后本氏烟叶片中泛素化蛋白鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 试剂及其配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 总蛋白的提取
• 2.3.2 蛋白样品的富集纯化
• 2.3.3 纯化蛋白的SDS-PAGE检测和Western-blot分析
• 2.3.4 纯化蛋白样品质谱检测
• 3 结果与分析
• 3.1 泛素化蛋白的纯化和富集及纯化蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 3.2 纯化蛋白的WESTERN-BLOT分析
• 3.3 纯化蛋白的质谱鉴定结果
• 4 讨论
• 全文小结
• 参考文献