产油酵母油脂合成与戊糖代谢的研究

论文摘要

目前,葡萄糖是微生物合成油脂的主要碳源。为了节约生产成本和扩大起始原料范围,寻求有效的替代性碳源是油脂生产工业化的一个重点发展方向。纤维素类物质是地球上最丰富的可再生资源之一,而木糖是纤维素类物质的主要水解产物之一,因此驯化油脂微生物高效利用木糖生产油脂对油脂工业的开发具有重要的指导意义。本文重点研究粘红酵母油脂合成过程中的关键酶以及其戊糖代谢机理。首先,本文考察了油脂过程中起关键作用的催化酶,并锁定其中的柠檬酸裂解酶（ATP-ACL）进行重点研究。实验过程中详细探究了粘红酵母的破壁原理,总结出两种可成功提取该酵母基因组的方法,即双酶玻璃珠法和液氮研磨法,其中双酶法获得的基因组较为完整。对于柠檬酸裂解酶基因的获取,尝试通过蛋白序列比对法设计正确的同源引物,并取得了一定的PCR扩增结果。其次,本文对比分析了产油粘红酵母对葡萄糖、木糖和上述两糖等摩尔数混合物的发酵利用和油脂合成情况。结果表明,在混合培养基中,粘红酵母优先将葡萄糖消耗完毕,经过约24h的胞内代谢系统调整期开始利用木糖,最终总糖利用率可达99%以上。同时,对三种培养基发酵所得油脂进行GC-MS分析可知,所产油脂甲酯化后的主要成分均为十八碳烯酸甲酯和十六碳酸甲酯。最后,本文考察了产油粘红酵母天然可利用戊糖的特性。从糖的运输机制入手,通过对比粘红酵母在高浓度葡萄糖和低浓度木糖培养下质膜蛋白表达的差异,分离分析具有诱导表达特征的戊糖运输蛋白。研究结果显示,粘红酵母中存在一种大小约为35kD的质膜蛋白,在以0.5%木糖为碳源时表达,而以4%葡萄糖为碳源时不表达。这说明该蛋白基因被木糖诱导表达,而被葡萄糖所抑制,符合戊糖运输蛋白在分子水平上的特性。因此,初步判定该蛋白为粘红酵母中的戊糖运输蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物油脂的研究背景
• 1.2 微生物油脂的研究进展
• 1.3 产油微生物的筛选与应用
• 1.4 生物质资源的研究背景及意义
• 1.5 微生物油脂合成的代谢研究
• 1.6 产油酵母利用戊糖的机理研究
• 1.7 本课题的研究内容及意义
• 1.7.1 粘红酵母对不同碳源的利用差别
• 1.7.2 粘红酵母油脂合成关键酶基因的获得
• 1.7.3 粘红酵母戊糖运输蛋白的分离鉴定
• 第二章 产油粘红酵母油脂代谢途径中柠檬酸裂解酶的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 所用菌种
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 实验材料
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产油酵母基因组提取的方法改进
• 2.3.2 未知基因同源引物的初步设计
• 2.3.3 油脂代谢关键酶——柠檬酸裂解酶的扩增
• 2.4 本章小结
• 第三章 粘红酵母利用不同碳源的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 所用菌种
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验材料
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 粘红酵母诱变前后油脂含量变化
• 3.3.2 粘红酵母对不同碳源的利用对比
• 3.3.3 粘红酵母在不同碳源下的生长对比
• 3.3.4 粘红酵母利用不同碳源产油脂的含量与组成对比
• 3.4 本章小结
• 第四章 粘红酵母天戊糖转运蛋白的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 所用菌种
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 实验材料
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 膜蛋白一维电泳系统的确定
• 4.3.2 膜蛋白电泳后染色方法的确定
• 4.3.3 膜蛋白电泳分离胶浓度的确定
• 4.3.4 提取质膜蛋白的三种方法对比
• 4.3.5 质膜蛋白双向电泳的初步结果
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录一 实验仪器
• 附录二 实验材料
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者与导师简介
• 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书