论文摘要
胞嘧啶甲基化是一个重要的表观遗传学修饰,分子和遗传学实验都表明生物体基因组胞嘧啶甲基化的动态平衡与基因组稳定和基因的转录沉默有关,并且在对转座子沉默,植物抗病,印记基因的正确表达等事件中起重要作用。目前的研究表明RNA介导的DNA甲基化（RdDM,RNA-directed DNA Methylation）是拟南芥胞嘧啶甲基化形成的重要机制,而负调控这一过程的研究未见报道。为了研究胞嘧啶甲基化的形成和由其介导的转录沉默的分子生物学机制,本文以拟南芥为材料,构建了两套DNA甲基化特征的研究系统（LUCH和YJ）,通过正向遗传学的方法发现一个编码HEAT SHOCK PROTEIN20（HSP2O）蛋白的基因LOW IN LUCIFERASE EXPRESSION （LIL）的突变使研究系统荧光素酶（LUC）的表达下降。为了揭示这一表型的分子生物学机制,我们通过生物化学,分子生物学和遗传学研究了LIL调控位点及调控方式的特异性和调控基因表达的机制。通过DNA甲基化和small RNA文库的全基因组学研究了LIL对全基因组胞嘧啶甲基化水平的影响,影响位点的基因组分布和这些位点与RdDM的关系。通过细胞生物学的方法,研究了LIL对RdDM功能蛋白AG04的细胞核定位的影响。我们还通过酵母双杂交发现了与L1L相互作用的蛋白。研究发现：（1）LIL突变体特异地影响RdDM调控的内源基因的表达;（2）LIL对基因的表达调控依赖胞嘧啶甲基化,当胞嘧啶甲基化消失或受到抑制时,LIL不影响LUC和RdDM内源基因的表达,即LIL作用于RdDM的下游,通过负调控RdDM,抑制基因的转录沉默;（3）LIL突变后引起全基因组CG和CHH型甲基化水平的升高,影响的这些基因的分布在基因组水平上与RdDM70%重合,而且这些位点与产生24nt-siRNAs的区域是紧密相连的;（4）LIL不影响24nt-siRNAs的生物合成,分布以及聚集,也不影响PolV的转录,而特异地影响AG04的细胞核定位,在突变体lil中,AG04出现了更强的聚集,多位点聚集和散布;（5）LIL与MBD5,MBD6和MBD7有直接的相互作用,这种互做被发现能影响特异位点基因的转录沉默。以上研究结果表明,LIL在RdDM的下游,通过负调控RdDM影响全基因组甲基化水平来抑制基因的转录沉默。首次报道的这种负调控机制维持了全基因组胞嘧啶甲基化的动态平衡,确保了基因的适时适量表达,保持了基因组的稳定性和遗传多样性。AG04细胞核定位的变化和LIL与MBDs的直接相互作用对负调控RdDM的生物学意义还有待更加深入的研究。
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标签：甲基化论文; 负调控论文; 全基因组文库的构建分析论文; 核定位论文;