论文题目: β地中海贫血的新突变鉴定和高通量突变检测方法研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 细胞生物学
作者: 莫秋华
导师: 徐湘民
关键词: 地中海贫血,移码突变,实时定量,突变筛查,荧光偏振光,单碱基延伸
文献来源: 第一军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: β地中海贫血(简称β地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一。β地贫在全球许多地区具有很高的发生率,目前已得到公认的原因是由于疟疾选择的结果。因此地贫主要分布在疟疾高发的热带亚热带地区,从地中海沿岸和非洲大部分地区到中东、印度次大陆、中国南方、东南亚、并延伸至印度尼西亚和太平洋地区,而美国、中美和南美等国因移民原因也成为高发地区。由于重型β地贫是致死性疾病,患者需要定期输血和去铁治疗以维持生命,因此,β地贫仍是这些地区最棘手的公共健康问题之一。对于一个地贫高发的社区或国家而言,控制该病的最有效途径是在遗传流行病学研究的基础上制订预防计划,通过实施大人群的筛查和高风险夫妇的产前诊断来防止重症患儿的出生。 β地贫是我国长江以南各省区高发的血液遗传病,广东、广西、海南、江西、台湾和香港等地尤为突出,受累的人口达2亿以上。本研究试图在β地贫的人群分子流行病学调查和/或临床实践中,发现新的β地贫致病基因并阐明其遗传学基础。此外,利用国际最新基因突变检测技术平台,建立适于中国人的高通量自动化β地贫常见突变检测技术。研究结果能为我国β地贫的遗传咨询、产前诊断和实施大人群的预防计划提供有价值的遗传学资料和筛查方法。 一、一种新的β~0地贫基因的鉴定 β地贫是由于β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链缺如(β°)或合成不足(β~+)而引起的遗传性溶血性贫血病,为常染色体隐性遗传病。β地贫的分子病理具有高度的异质性,主要为11号染色体上β-珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。目前全世界已报道的基因突变类型达200多种,每个种族人群有其自身的常见突变类型。在我国人群中,截止现在,已发现的β地贫突变类型有33种之多。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一部分：一种新的β~0地贫基因的鉴定
第1章 引言
第2章 实验材料
2．1 仪器及生物学分析软件
2．2 试剂
2．3 标本
第3章 实验方法
3．1 鉴定β地贫新突变的研究策略
3．2 β地贫血液学表型分析
3．3 中国人β地贫24种突变的检测
3．3．1 外周血基因组DNA的制备
3．3．2 PCR扩增β-珠蛋白基因
3．3．3 反向点杂交(RDB)实验
3．4 β地贫新突变的发现和基因分型
3．4．1 DNA序列测定
3．4．2 RDB法用于新突变基因分型
3．5 mRNA水平的功能研究
3．5．1 总RNA的提取和质量鉴定
3．5．2 β-珠蛋白基因mRNA水平分析
3．6 β-珠蛋白基因簇单倍型分析
第4章 实验结果
4．1 先证者及其家庭成员血液学表型数据
4．2 β地贫新突变基因型鉴定
4．2．1 中国人β地贫24种突变分析结果
4．2．2 DNA序列测定结果
4．2．3 RDB法基因分型新突变
4．3 β地贫新突变mRNA水平分析结果
4．3．1 总RNA的质量鉴定
4．3．2 引物的质量鉴定
4．3．3 实时荧光定量RT-PCR反应的特异性评价
4．3．4 构建相对定量标准曲线
4．3．5 实验数据的标准化和mRNA相对定量结果
4．4 β地贫基因RFLP单倍型的确定
第5章 分析与讨论
5．1 β地贫表型与基因型分析
5．2 CDs15／16(+G)移码突变产生机理分析
5．3 CDs15／16(+G)移码突变的功能分析
5．3．1 实时荧光定量RT-PCR实验分析
5．3．2 β-珠蛋白mRNA水平降低的可能机制
5．4 β-珠蛋白基因簇单倍型分析
第6章 参考文献
第二部分 基于荧光偏振的高通量β地贫突变检测方法研究
第1章 引言
第2章 实验材料
2．1 仪器及生物学分析软件
2．2 试剂
2．3 样品
第3章 实验方法
3．1 方法学研究的技术路线
3．2 DNA样品的选择及制备
3．3 引物设计
3．4 PCR扩增β-珠蛋白基因的效率和特异性评价
3．5 SBE-FP法平行检测中国人β地贫8种突变
3．5．1 PCR扩增目的基因
3．5．2 残余引物和dNTP的降解
3．5．3 单碱基延伸(SBE)反应和荧光偏振(FP)检测
3．6 动力学实验优化SBE-FP反应条件
3．7 用SBE-FP法对阳性控制样品进行基因分型
3．8 盲法实验评价SEB-FP法的特异性
第4章 实验结果
4．1 PCR产物特异性评价
4．2 实验条件的优化结果
4．3 阳性控制样品基因分型结果
4．4 特异性评价实验
第5章 分析与讨论
第6章 参考文献
附录：英文缩写词中英文对照表
攻读博士学位期间(01．9—05．6)成果
致谢
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学位论文版权使用授权书
发布时间: 2006-01-06
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