多拉菌素高产菌株氮离子注入诱变育种和发酵工艺研究

论文摘要

多拉菌素是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,由阿维链霉菌的bkdFGH基因缺失突变株发酵过程中添加环己羧酸生物合成,为阿维菌素第三代衍生物,与其它阿维菌素类产品比较,其抗寄生虫范围更广泛、杀虫活性更高,预防寄生虫再感染有效时间更长,被认为是最有开发潜力的兽用抗寄生虫新药。本文对96孔板高通量筛选多拉菌素高产菌株的方法进行了初步探索,通过前体及终产物耐受实验与氮离子诱变选育获得多拉菌素产量提高的菌株,并对其进行摇瓶发酵工艺优化,同时研究了前体对多拉菌素生物合成的影响。主要结论如下:1、通过前体耐受性筛选,获得一株产量提高60.62%的菌株,前体CHC对该菌株的最小抑制浓度为300μg/mL。2、通过氮离子注入诱变,获得了氮离子注入阿维链霉菌的双峰型存活率曲线。3、通过考察阿维链霉菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,发现固体培养基上阿维链霉菌生长情况良好,而发酵培养基由于CHC与CaCO3均不溶于水且不可替代,因此要利用96孔板初筛高产菌株必须要克服这个困难。4、考察碳氮源单因素、双因素、无机氮源、无机盐与微量元素实验对多拉菌素发酵的影响,并使用Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面法获得了高产菌株的最佳发酵培养基配方（g/L）:玉米淀粉75,干酵母18,KCl 1.35,MgSO40.16,K2HPO4.3H2O 1.8,FeSO4.7H2O 0.012,Na2Mo4.2H2O 0.045,NH4Cl 0.09,CoCl2·6H2O 0.005,CaCO32。此时,多拉菌素发酵单位比对照提高了1.8倍,达103.54μg/mL。5、通过对菌株发酵条件的研究,结果表明该菌株发酵时不添加玻璃珠,摇瓶装量为30mL,初始pH为7.0,种龄72h,移种量6%,自来水配制发酵培养基,适于多拉菌素发酵。6、通过考察外源性前体对多拉菌素生物合成的影响,环己羧酸在培养48h添加300μg/mL适宜;氨基酸对多拉菌素合成有抑制作用;而低级脂肪酸中,丙酸钠对多拉菌素生物合成的促进作用优于其他脂肪酸,在发酵培养4d时添加0.1%丙酸钠,多拉菌素产量达139.89μg/mL,比对照提高了38.2%。7、通过对多拉菌素产量有促进作用的前体乙酸钠、丙酸钠、柠檬酸三钠的正交实验设计,多拉菌素产量提高9.39%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 微生物农药
• 1.1.1 微生物农药概述
• 1.1.2 微生物农药的分类
• 1.1.3 农用抗生素的研究与应用现状
• 1.2 多拉菌素的研究进展
• 1.2.1 多拉菌素来源
• 1.2.2 多拉菌素的理化性质
• 1.2.3 多拉菌素生物合成途径
• 1.2.4 多拉菌素的作用机理
• 1.2.5 多拉菌素的抗虫谱
• 1.2.6 多拉菌素的在动物体内残留的研究
• 1.2.7 多拉菌素在兽医临床中的应用
• 1.3 论文的研究意义和内容
• 1.3.1 研究意义
• 1.3.2 研究内容
• 第2章 多拉菌素高产菌株氮离子注入诱变育种
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 培养条件
• 2.3.2 单孢子悬液的制备
• 2.3.3 前体耐受菌株的筛选
• 2.3.4 终产物耐受菌株的筛选
• 2.3.5 菌株的氮离子注入诱变选育
• 2.3.6 96 孔板高通量初筛多拉菌素高产菌株条的研究
• 2.3.7 pH值的测定
• 2.3.8 多拉菌素的高效液相色谱检测
• 2.3.9 实验数据分析统计方法
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 环己烷羧酸耐受菌株的实验结果
• 2.4.2 终产物耐受菌株的实验结果
• 2.4.3 氮离子注入诱变结果
• 2.4.4 96 孔板高通量初筛多拉菌株高产菌株的研究
• 2.5 讨论
• 第3章 多拉菌素发酵工艺研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂与仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养条件
• 3.3.2 阿维链霉菌产多拉菌素的发酵曲线测定
• 3.3.3 碳源单因素实验
• 3.3.4 有机氮源单因素实验
• 3.3.5 确定碳氮比
• 3.3.6 碳氮源双因素实验
• 3.3.7 无机氮源单因素实验
• 3.3.8 无机盐单因素实验
• 3.3.9 微量元素单因素实验
• 3.3.10 利用Placett-Burman实验设计（PBD）选择显著性因素
• 3.3.11 最陡爬坡路径实验逼近最大响应区域
• 3.3.12 响应面法（RSM）-中心组合设计（CCD）实验
• 3.3.13 发酵条件研究
• 3.3.14 计算及统计方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 阿维链霉菌产多拉菌素的代谢曲线实验结果
• 3.4.2 碳源单因素实验结果
• 3.4.3 有机氮源单因素实验结果
• 3.4.4 碳氮比的确定
• 3.4.5 碳氮源双因素实验结果
• 3.4.6 无机氮源单因素实验结果
• 3.4.7 无机盐单因素实验结果
• 3.4.8 微量元素单因素实验结果
• 3.4.9 Placett-Burman实验结果
• 3.4.10 最陡爬坡实验结果
• 3.4.11 响应面实验
• 3.4.12 发酵条件研究
• 3.5 讨论
• 第4章 外源性前体多拉菌素生物合成的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与试剂
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 培养条件
• 4.3.2 多拉菌素的高效液相色谱检测
• 4.3.3 pH值的测定
• 4.3.4 菌丝体干重的测定
• 4.3.5 环己烷羧酸对多拉菌素合成的影响
• 4.3.6 氨基酸对多拉菌素生物合成的影响
• 4.3.7 低级脂肪酸对多拉菌素生物合成的影响
• 4.3.8 前体添加浓度对多拉菌素生物合成的影响
• 4.3.9 前体加入时间的考察
• 4.3.10 前体正交实验
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 环己烷羧酸对多拉菌素合成的影响
• 4.4.3 低级脂肪酸对多拉菌素生物合成的影响
• 4.4.4 前体添加浓度对多拉菌素生物合成的影响
• 4.4.5 丙酸钠添加时间的选择
• 4.4.6 前体正交实验
• 4.5 讨论
• 第5章 结论、创新和展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果