基于树突状细胞的打破免疫耐受新策略及其机制研究

论文摘要

机体对自身抗原免疫无应答是免疫耐受的主要体现，它对于建立和维持机体免疫自稳、预防自身免疫性疾病的发生具有重要的意义。然而，慢性感染性病原体以及改变的自身抗原——肿瘤抗原则通过尚未完全明确的机制诱导了机体免疫系统对这些抗原的特异性免疫耐受，从而导致病原体的慢性感染和肿瘤的发生发展。绝大多数肿瘤抗原是机体自身蛋白质，仅在肿瘤发生时过量或异位表达，由于机体免疫系统对自身抗原的免疫耐受，因此难以激发对肿瘤抗原有效的免疫应答，不能清除肿瘤；同样，在慢性乙型肝炎中机体对乙肝病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的先天或获得性免疫耐受亦是乙肝慢性感染的重要原因之一，使得至今尚无有效方法防治肿瘤和慢性乙肝的发生。此外，免疫耐受的失衡与一些疾病的发生密切相关，如TNBS诱导的炎症性结肠炎是一种由过度炎性反应导致肠道炎症损伤的难治性疾病，作为自身抗原的IL-12过量表达是引起炎症性结肠炎的主要原因之一。因此，如何清除过度表达的肿瘤抗原、自身抗原或病毒性抗原以维持机体免疫自稳呢?从根本而言，唯有打破对肿瘤抗原和病原体抗原以及自身抗原的免疫耐受，诱导针对肿瘤抗原、病毒性抗原或自身抗原的特异性免疫应答以清除过度表达的抗原，是用主动手段消除肿瘤或自身抗原过表达或病毒抗原表达导致的炎症病理反应、有效防治肿瘤、慢性感染性疾病等的根本策略。如何打破自身免疫耐受、诱导针对已发生天然或获得性免疫耐受的自身或外源抗原的特异性免疫应答呢?已知APC对抗原的有效处理和提呈是诱导特异性免疫应答的关键，专职APC—DC的成熟状态、表面MHC分子、共刺激分子的表达水平极大程度决定了免疫激活或者免疫耐受的发生。有研究显示：若以未成熟DC荷抗原肽免疫小鼠时，在引流淋巴结中T-DC细胞仅有多次短暂接触，结果引起免疫耐受，而以成熟DC荷相同抗原肽免疫小鼠时，T-DC长时间稳定接触，最终引起免疫激活。通常认为DC迁移的过程伴随着其成熟，未成熟DC介导免疫耐受，而成熟DC诱生免疫应答。以上研究提示：通过调控机体专职APC的抗原提呈功能和提呈效率，可能克服机体对抗原的免疫耐受状态，再次诱导免疫应答来清除耐受原，从而降低相关疾病的发病或致病程度。为此，本研究提出设想：如果通过人为方法，将大量DC富集在抗原免疫部位，并通过一定手段促使DC成熟，则可能通过增强DC对自身抗原的提呈，诱导对耐受原的有效应答、清除过量表达的耐受原，达到防治慢性感染性疾病、肿瘤及自身免疫病的功能。若要实现上述假设，首先必须将大量DC趋化到抗原局部，而趋化因子就具有趋化免疫细胞到达感染或免疫部位、活化免疫细胞的功能。因此我们希望通过趋化因子来趋化DC到达免疫局部和增强抗原提呈功能。CCL20是CC家族中的趋化因子，主要趋化未成熟DC、活化的B细胞和T细胞。以往研究表明CCL20基因免疫可招募大量未成熟DC发挥抗肿瘤作用。此外，Flt3L是一种具有促进骨髓造血干细胞生长和前体细胞分化、成熟的细胞因子，有助于DC增殖和成熟。在以上研究基础和背景下，本研究提出如下设想：联合应用自身抗原或病毒抗原基因疫苗和CCL20、flt3L佐剂基因进行基因共免疫，通过增强基因疫苗的免疫效果，希望能打破机体对自身抗原的免疫耐受。其中，CCL20有助于招募大量未成熟DC到达免疫局部，而flt3L则促进DC在迁移至引流淋巴结的过程中发育成熟并上调抗原提呈功能，从而更有效激活T细胞，诱导特异性免疫应答。以自身抗原-CCL20-flt3L联合基因免疫策略有望打破对自身／人工耐受抗原的耐受状态，诱导对耐受抗原的特异性免疫应答。为证实这种假设，本研究选取三种不同抗原（B16F10肿瘤模型的mgp100自身抗原、HBV转基因鼠的HBsAg人工耐受原、TNBS诱导的炎症性结肠炎中的IL-12p40自身抗原）进行平行研究以探讨自身抗原（病毒抗原）／CCL20／flt3L基因共免疫策略是否有助于打破对自身抗原／病毒抗原的免疫耐受状态。在此基础上，进一步观察该策略诱导的增强的特异性免疫应答是否可对疾病动物模型产生免疫保护作用；并对其预防或治疗作用的机制进行探讨，以期为相关疾病的生物学防治提供新的理论基础和实验依据。1．多种重组质粒的构建、体外表达及功能分析我们首先构建了含有趋化因子CCL20、细胞因子flt3L、自身抗原TL-12p40亚基和其融合基因的质粒pcDNA3-CCL20（pCCL20）、pcDNA3-flt3L（pf3L）、pcDNA3-IL-12p40（p40）、pcDNA3-CCL20-flt3L（pCCL20-f3L）、pcDNA3-CCL20-IL-12p40-flt3L（pCCL20-40-f3L）等。以电穿孔法将质粒导入C2C12小鼠肌细胞，获得转染细胞C2C12-CCL20、C2C12-flt3L、C2C12-IL-12p40等。将以上转染细胞的表达上清浓缩后进行Western blot分析可见明显特异性条带，证实以上所构建的重组质粒能够在体外进行有效表达。pCCL20表达上清的活性分析显示：该表达上清对脾淋巴细胞有明显的趋化作用，趋化指数达9.18±0.78，而不含有该趋化因子的表达上清则对脾淋巴细胞不表现出明显的趋化效应，其趋化指数为0.84±0.40（P=0.001）。体内实验显示：CCL20能够趋化细胞到达局部免疫部位，其细胞浸润指数为1.667±0.333，比对照组（0.333±0.211）显著增加（P=0.007）。进一步的研究显示CCL20趋化细胞到达免疫局部的效应不仅增强体液免疫，而且可增强细胞免疫。flt3L的活性分析显示：该细胞因子对培养的树突状细胞表面共刺激分子有明显的上调作用，即可促进DC的成熟，培养上清细胞因子检测显示IL-12p70的表达显著增加，为660.9±25.44pg／ml，而对照组为110.4±11.03pg／ml（P=0.000），也从另外一个侧面证实了该细胞因子有促进DC成熟的作用。以上结果提示：所有构建的重组质粒均可在体外得到有效表达，且表达的CCL20和flt3L蛋白具有相应的生物学功能。2．CCL20／flt3L／p40基因共免疫可打破机体对p40的免疫耐受为了研究采用pCCL20／pflt3L／pIL-12p40质粒共免疫是否能够打破针对自身抗原p40的免疫耐受，我们通过肌肉注射基因免疫的方式，将含有CCL20、flt3L和p40的重组质粒以及pcDNA3-CCL20-flt3L（pCCL20-f3L）、pcDNA3-CCL20-IL-12p40-flt3L（pCCL20-40-f3L）的含有融合基因的质粒免疫6-8周龄的雌性BALB／c小鼠。单一重组质粒混合免疫组和融合质粒免疫组均在加强免疫后一周出现抗IL-12p40抗体，提示免疫后IL-12p40的免疫耐受被打破，但该抗体的滴度较低，二次加强免疫也不能有效提高抗体的水平。为了有效提高抗体的产生，我们进一步优化了免疫策略，发现在含有CCL20、flt3L和p40的重组质粒的质量比为4：4：100时，抗IL-p40抗体的效价最好，经再次免疫后一周，抗体滴度达最高，为1：8000；局部免疫部位的DC细胞浸润数目达最多，然而，若进一步提高趋化因子CCL20和flt3L重组质粒的浓度，其细胞的浸润程度并不增加（P＞0.05），而抗体的效价反而下降（P＜0.05）。改变几种重组融合质粒的量和比例进行免疫始终未能提高抗体的效价，因此本研究的后续实验均采用三种质粒的量的比例（抗原：CCL20：flt3L）为4：4：100的单一质粒混合免疫方式进行免疫。以上结果表明只有pCCL20、pflt3L和含编码自身抗原p40的重组质粒共免疫才能够打破针对IL-12p40的免疫耐受。为进一步确认IL-12p40的耐受状态是否被打破，我们系统研究了抗体产生的滴度、特异性和亲和力。我们采用0、3、6w免疫方案，在免疫的第2、4、6、8、10、12w分别收集小鼠血清进行抗体的检测。结果显示：单纯使用不同剂量的pIL-12p40免疫，均不能产生针对p40的特异性抗体；在pIL-12p40／pCCL20共免疫组和pIL-12p40／pflt3L共免疫组也未能检测到相应抗体的存在；但在pIL-12p40／pCCL20／pflt3L质粒共免疫组却能够检测到抗体的存在，在第8周其抗体滴度达1：3600。以硫氰酸盐竞争抑制法测定其抗体的亲和力表明在第4、8周分别为1.3、1.5。以重组IL-12p40蛋白进行血清中和实验发现，该抗体可以被重组IL-12p40中和，中和后抗体检测OD值为0.149±0.03，显著低于未加入IL-12p40中和的对照组（0.97±0.14）（P=0.005），表明其为抗-p40特异性抗体。以上结果显示使用pCCL20、pflt3L和含编码自身抗原p40重组质粒共免疫策略能够产生针对p40的特异性的体液免疫。为进一步确证该免疫方案能否打破针对p40的免疫耐受，我们检测了免疫小鼠的细胞免疫应答水平。结果显示：由特异性抗原p40（5μg／ml）引起的增殖反应可以被系列稀释的免疫小鼠的抗血清所抑制（若这一反应是由IL-2而非p40引起，则该反应不会被系列稀释的免疫小鼠的抗血清所抑制），表明该增殖反应是p40特异性的。脾脏CD8+IFN-γ+T效应细胞的存在是被免疫动物存在细胞免疫反应的主要指标之一。经FACS分析脾脏CD8+IFN-γ+T细胞显示：在pcDNA3、pIL-12p40、pIL-12p40／pCCL20、pIL-12p40／pflt3L、pIL-12p40／pCCL20／pflt3L质粒共免疫组CD8+IFN-γ+T效应细胞的比例分别为0.25±0.04％、0.23±0.01％、0.27±0.05％、0.27±0.06％、1.64±0.09％。pIL-12p40、pCCL20和pflt3L三质粒共免疫组CD8+IFN-γ+T效应细胞比例显著高于其他组（P=0.000），而其他各组之间则没有显著的差别（P值均大于0.05）。以上结果提示，无论是在体液免疫水平还是在细胞免疫水平，只有用pCCL20、pflt3L和含编码自身抗原p40的重组质粒共免疫才能打破针对p40的免疫耐受。3．CCL20／flt3L／p40基因共免疫可防治炎症性结肠炎由TNBS诱导产生的炎症性结肠炎动物模型是Th1型的，主要由效应分子IL-12介导。而IL-12是由p35和p40两个亚基组成的异二聚体分子，其生物学效应的发挥有赖于其完整的结构。已有的文献显示p40基因敲除小鼠，TNBS诱导的炎症性结肠炎明显减轻。为了验证产生的抗-p40特异性抗体的效应，我们首先复制了TNBS介导的炎症性结肠炎模型。结果显示：在对照组小鼠，即40％乙醇处理组，在用药后小鼠的体重呈增加趋势，其波动范围在100-110％范围内（103.30±0.75）；而TNBS处理组（0天、7天两次给药）则在第2天和第9天由于腹泻脱水体重降至最低，分别为其0天体重的84.5％和87.2％，在9天时间内体重均未回升到第0天的基础水平（91.37±1.77）。在TNBS处理组，小鼠的患病率为100％，大体肉眼观察积分为11.63±0.53，髓过氧化物酶水平为1.26±0.05 OD／g组织，结肠的湿／干比为6.45±0.16，平均食物消耗量为1-2（1.53±0.14）g／天，而40％乙醇处理组，小鼠的患病率为6.25％，大体肉眼观察积分为0.88±0.40，髓过氧化物酶水平为0.61±0.02 OD／g组织，结肠的湿／干比为4.18±0.12，食物平均消耗量为4-6（5.30±0.12）g／天。以上有关炎症性结肠炎的各项指标，40％乙醇处理组和TNBS处理组之间均表现显著差异（P均小于0.001）。形态学观察显示TNBS处理组小鼠结肠没有或者少有粪便充盈，明显区别于40％乙醇处理组小鼠的大量节段性的粪便充盈，且其脾脏相对于40％乙醇处理组小鼠明显增大。组织学研究显示40％乙醇处理组小鼠的结肠肠腔规则，绒毛伸入肠腔，仅有少量炎症细胞浸润；而TNBS处理组小鼠的黏膜层呈节段性破坏，有大量的炎症细胞浸润，局部黏膜层甚至完全消失。在TNBS处理后5w的小鼠结肠表面有大量不规则分布的结节，几乎无粪便充盈，组织学显示大量细胞浸润于黏膜层及黏膜层和肌层之间，呈现慢性炎症表象。在复制结肠炎动物模型的基础上，我们在建模后一周，进行pIL-12p40／pCCL20／pflt3L质粒共免疫，3周后加强免疫一次，再一周后处死小鼠，进行组织学观察显示：在经TNBS处理后免疫组小鼠结肠未见明显的炎症细胞浸润，结肠的大体结构未明显受损，绝大多数结肠有规则的粪便充盈，肾脏免疫组化未见有明显的免疫复合物沉积；对于经TNBS处理后未免疫组，则绝大多数结肠无粪便充盈，表面有不规则突起和水肿表现，组织学显示有大量单个核细胞浸润，局部组织破坏严重。抗IL-12p40抗体产生后对TNBS诱导的结肠炎的预防作用的实验研究显示：小鼠再次免疫一周后，以TNBS诱导结肠炎模型，仅有29.2±11.0％的小鼠患病，且其患病的程度也大为减轻。具体表现为：其体重的降低不低于0天的90％，且在TNBS处理第二天开始即上升，到第6-7天就恢复到初始水平。其食物消耗量为每天3.54±0.51g，髓过氧化物酶MPO水平为0.81±0.04 OD／g组织，结肠的湿／干比为5.21±0.20，大体肉眼观察积分为2.00±0.87，与TNBS处理组比较均有显著性差异（P均小于0.001）。形态学研究表明免疫后小鼠进行TNBS处理，结肠的大体形态无明显异常，脾脏有增大，组织学观察显示有部分小鼠的黏膜层内有少量的炎症细胞浸润，但黏膜层、肌层的大体形态仍然完好。这些结果提示进行pIL-12p40／pCCL20／pflt3L质粒共免疫打破IL-12p40的免疫耐受后对由TNBS介导的Th1型炎症性结肠炎模型具有有效的防治作用。4．CCL20／flt3L／p40基因共免疫打破p40免疫耐受机制的研究正常情况下，机体不会对自身的成分产生免疫应答，而我们以含有CCL20、flt3L的重组质粒和含编码自身抗原p40的重组质粒共免疫的方式却打破了针对p40的免疫耐受。为了进一步探讨该实验现象的机制，我们以相同的免疫剂量和免疫方式对BALB／c小鼠进行肌肉免疫，结果显示在单独使用pIL-12p40免疫时，肌肉局部仅有很少的炎性细胞浸润（0.67±0.21），而pIL-12p40／pCCL20共免疫组有较多的炎性细胞浸润（1.67±0.33），pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三质粒共免疫组有大量的细胞浸润（2.67±0.21）（三组比较P值均小于0.01）。基于CCL20仅对CCR6+的细胞有趋化作用，CCR6+表达于T、B、DC细胞上，而flt3L能够促进骨髓细胞的扩增和成熟，因此我们分别以免疫组化和流式细胞术对局部浸润细胞的种类进行了分析。免疫组化结果显示：该群细胞绝大部分为S100+CD19-CD3-的细胞，而FACS结果表明该群细胞的81.26％为CD11c+CD19-CD3-的细胞，两种实验方法均提示在局部浸润的是树突状细胞。以抗-CCR6的抗体局部注射pCCL20、pflt3L和pIL-12p40共免疫的小鼠，局部免疫部位的细胞浸润显著减少（3.00±0.00 vs 1.50±0.34，P=0.000），且在抗-CCR6抗体封闭组小鼠血清中未检测到抗-p40抗体的产生。通常，免疫学理论认为未成熟DC介导免疫耐受，而成熟DC与免疫应答的激活有关。因此，以CCL20、flt3L的重组质粒和含编码自身抗原p40的重组质粒共免疫的方式打破针对p40的免疫耐受现象是否是由于改变了DC的成熟度呢?为深入探讨该推论，我们进一步观察了免疫7天后脾脏和局部引流淋巴结的DC数量和成熟度。结果显示：在局部引流淋巴结，pIL-12p4／pCCL20／pflt3L三质粒共免疫组DC的数量（21.10±2.10×103／LN）较pcDNA3免疫组（7.41±0.42×103／LN）、pIL-12p40免疫组（7.85±0.19×103／LN）、pIL-12p40／pCCL20免疫组（9.05±0.23×103／LN）、pIL-12p40／pflt3L免疫组（7.83±0.20×103／LN）均显著增加（P均小于0.001），而其他组之间未见显著差异（P均大于0.05）。同时在局部引流淋巴结，pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三质粒共免疫组DC分子表面共刺激分子CD80／CD86／CD40和MHCⅡ类分子的平均荧光强度（成熟度）较pcDNA3免疫组、pIL-12p40免疫组、pIL-12p40／pCCL20免疫组、pIL-12p40／pflt3L免疫组均显著增加（P均小于0.05），而其他组之间未见显著差异（P均大于0.05）。在脾脏，pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三质粒共免疫组DC的数量和成熟度较pcDNA3免疫组、pIL-12p40免疫组、pIL-12p／40／pCCL20免疫组、pIL-12p40／pflt3L免疫组均未见显著增加（P均大于0.05）。提示CCR6+的DC细胞在肌肉注射局部的大量浸润，以及在局部引流淋巴结的成熟度增加可能是导致自身抗原p40免疫耐受被打破的原因。综上所述，单纯以编码自身抗原基因IL-12p40的重组质粒免疫小鼠不能产生特异性免疫应答，采用含CCL20、flt3L和自身抗原的编码基因的重组质粒共免疫可打破对自身抗原TL-12p40的免疫耐受，产生特异性的免疫应答，该免疫应答对由TNBS诱导产生的由IL-12这一效应分子介导的Th1型炎症性结肠炎模型具有有效的防治作用。对该现象机制的进一步研究显示：在含CCL20、flt3L和自身抗原p40的编码基因的重组质粒共免疫局部免疫部位浸润的细胞绝大部分为DC，用抗-CCR6抗体可以封闭DC浸润至局部免疫部位和特异性抗体的产生，在免疫附近的引流淋巴结DC细胞的数量和成熟度显著增加。本课题中除使用IL-12p40这一自身抗原外，我们还采用含CCL20／flt3L／HBsAg的重组质粒共免疫HBV转基因鼠打破了HBsAg的免疫耐受（见附件2）；用含CCL20／flt3L／mgp100的重组质粒共免疫诱导C57BL／6小鼠针对mgp100的特异性免疫应答反应，后者对B16F10肿瘤细胞的攻击具有免疫保护作用（见附件1）。本研究提示提高免疫局部DC细胞的数量和成熟度可逆转机体对自身抗原的免疫耐受状态，通过打破对自身抗原的耐受可诱导针对自身抗原或病毒抗原的特异性免疫应答，从而有效防治自身免疫病的发生发展。本研究为临床治疗自身抗原过量表达引起的自身免疫疾病提供了理论和实验基础，同时为通过打破免疫耐受对肿瘤以及病毒慢性感染进行主动免疫防治提供了新的策略和思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 多种重组质粒的构建、体外表达及功能分析
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 CCL20/flt3L/p40基因共免疫可打破机体对p40的免疫耐受
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 CCL20/flt3L/p40基因共免疫可防治炎症性结肠炎
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 CCL20/flt3L/p40基因共免疫打破p40免疫耐受机制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附件1 CCL20/flt3L/mgp100基因共免疫打破肿瘤免疫耐受的研究
• 附件2 CCL20/flt3L/HBsAg基因共免疫打破HBV转基因鼠免疫耐受的研究
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献