论文摘要
研究背景糖皮质激素（glucocorticoids, GC）具有广泛的抗炎和免疫抑制作用,是治疗哮喘、慢性阻塞型肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease , COPD）及肺纤维化等呼吸系统疾病的一种常见药物。糖皮质激素与糖皮质激素受体（glucocorticoids receptor,GR）结合后进入核内,发挥抗炎作用。GRα和GRβ系GR基因经过不同的剪接途径产生两种主要的剪接异构体,其中GRα的表达水平和功能状态是影响GC发挥抗炎效应的主要因素。有关GC作用的分子生物学机制已经有了较为深入透彻的研究,但是以往这些研究多是在常氧状态上进行的,GC在人体内发挥作用是一个非常复杂的过程,机体的功能状态和人体细胞所处的微环境可能影响GC的各项作用。Leonard等研究发现,低氧可上调人近端肾小管上皮细胞GR的表达并增加GC的敏感性。低氧是哮喘、COPD等呼吸系统疾病发作时常常伴有的一种病理生理状态,低氧是否可以调节人体气道细胞的GR表达并影响GC抗炎效应尚不明确。目的本研究以人肺泡上皮A549细胞为模型,观察低氧对A549细胞形态及增殖周期的影响;研究低氧对人肺泡上皮细胞GRα和GRβ的表达的影响;研究低氧对地塞米松抑制LPS刺激人肺泡上皮细胞产生的IL-8的效应的影响。方法1.A549细胞低氧培养人肺泡上皮A549细胞放入普通培养箱（37℃, 95%空气、5% CO2,常氧）和低氧小室（37℃,95%N2、25 % CO2,低氧）分别培养24h,48h,72h。2.微分干涉显微镜（DIC）观察低氧对人肺泡上皮A549细胞形态的影响将细胞分别种于6个35mm的培养皿中,24h后更换培养基,再分别常氧和低氧条件下培养24h,48h,72h。DIC拍摄观察低氧和常氧各时间点培养的细胞形态的改变。3.流式细胞术检测低氧对人肺泡上皮A549细胞增殖周期的影响将细胞分别种于35mm的培养皿中,待细胞贴壁后再更换无血清培养基培养24h,以达到各组细胞生长周期同步化,然后再分别低氧和常氧培养48h,收集细胞,用流式细胞术检测细胞增殖周期的变化。4.RT-PCR检测低氧对人肺泡上皮A549细胞GRα和GRβ的mRNA表达的影响细胞常氧和低氧条件下分别培养24h,48h,72h,收集细胞抽取总RNA,然后RT-PCR法分别检测各组细胞GRα和GRβ的mRNA表达的变化5. Western Blot检测低氧对人肺上皮A549细胞GRα和GRβ的蛋白表达的影响。细胞常氧和低氧条件下分别培养24h,48h,72h,收集细胞提取总蛋白,然后Western Blot法分别检测各组细胞GRα和GRβ的蛋白表达的变化。6.放射免疫法检测低氧对地塞米松抑制LPS刺激产生的IL-8的影响将细胞调整至合适密度种于24孔板中,待第二天细胞贴壁且呈基本融合状态时,弃去之前的完全培养基,用PBS洗两遍后,换成无血清的培养基,并在培养基中加入LPS（10ug/ml）和不同浓度的地塞米松（10-8M-10-6M）,分别低氧和常氧培养48h,然后收集细胞上清,用放射免疫法检测上清中的IL-8水平。7.统计方法所有试验至少分4次独立完成,数据用均数±标准误表示。多组间的差异用one-way ANOVA分析,两组之间的差异用t检验,统计在SPSS 10.0软件统计包中进行,P<0.05表示差异有显著性。结果1.低氧时间依赖性的引起人肺泡上皮A549细胞形态学改变用DIC方法分别拍摄24h、48h、72h常氧和低氧条件下培养的细胞发现:低氧24h组细胞形态较常氧24h组无明显改变;而低氧48h组的细胞与常氧48h组细胞相比,细胞变大,扁平,边界模糊,细胞密度减低;低氧72h组的细胞与常氧72h组的细胞相比,这种变化趋势更加明显。2.低氧导致人肺泡上皮A549细胞增殖受阻流式细胞术检测发现:低氧48h组的细胞,处于G1期的为88.2±0.82%,而常氧48h组的细胞处于G1期为78.2±0.64%,在低氧48h组处于G1期的细胞比例明显大于常氧48h组G1期的细胞比例,说明低氧引起了人肺泡上皮A549细胞增殖受阻。3.低氧时间依赖性的导致人肺泡上皮A549细胞GRα表达下降RT-PCR和Western Blot结果均表明:低氧24h组和常氧24h组相比,GRα表达的mRNA和蛋白水平无明显改变;而低氧48h组的细胞与常氧48h组细胞相比,GRα表达的mRNA和蛋白水平明显下降;低氧72h组的细胞与常氧72h组细胞相比,GRα表达下降更加明显。而且,低氧24h、48h、72h组的细胞, GRα表达的mRNA和蛋白水平呈进行性下降,说明低氧可时间依赖性的导致人肺泡上皮细胞GRα的表达下降。4.低氧对人肺泡上皮A549细胞GRβ的表达无明显影响RT-PCR和Western Blot结果表明:24h、48h、72h组常氧组和低氧细胞组相比, GRβ的表达的mRNA和蛋白水平均无明显改变。而且,低氧24h、48h、72h组细胞, GRβ表达的mRNA和蛋白水平也无明显改变,说明低氧对人肺泡上皮细胞GRβ的表达无明显影响。5.低氧导致地塞米松在人肺泡上皮细胞抑制IL-8的效应减弱放射免疫法结果表明, 48h低氧培养的DEX+LPS组细胞上清的IL-8水平在10-7M和10-6M DEX浓度时,均高于相应的常氧下的DEX+LPS组细胞。而且,在低氧时,达到最大抑制效应的DEX浓度为10-7M;而在常氧时,提高DEX浓度至10-6还可以继续增加DEX的抑制效应,说明在人肺泡上皮A549细胞,低氧可导致DEX抑制IL-8的抗炎效应减弱。结论1.低氧时间依赖性的引起人肺泡上皮A549细胞形态改变;2.低氧导致人肺泡上皮A549细胞增殖受阻;3.低氧时间依赖性的导致人肺泡上皮A549细胞GRα表达下降,而对人肺泡上皮A549细胞GRβ的表达无明显影响;4.低氧导致DEX在人肺泡上皮细胞的抗炎效应减弱。