论文摘要
前言大肠癌是发病率很高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第四，并且呈逐年上升趋势。目前研究表明肿瘤表面抗原的调变，MHC抗原表达不足及细胞因子产生减少等多种因素造成肿瘤局部处于免疫抑制状态，肿瘤细胞可以逃避机体的一系列免疫监视机制而继续发生发展，这可能是肿瘤细胞难以控制的主要原因之一。因此，提高局部活化的免疫效应细胞数量，以逆转肿瘤局部的免疫抑制状态进而激发起强烈的抗肿瘤免疫反应，可能是机体得以排斥肿瘤的有效手段，这也是目前肿瘤免疫治疗的一个主要目的。在寻找有效的免疫反应激活剂用于抗肿瘤的研究中，超抗原以其强烈激活T淋巴细胞的特性而备受关注。超抗原是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和病毒的产物，其不需要抗原提呈细胞的加工处理，可直接以完整的蛋白质形式与抗原提呈细胞膜上的MHC-Ⅱ类分子结合而被提呈到T细胞，与TCR的Vβ片段特异性结合，形成MHC-Ⅱ-SAg-TCR-Vβ复合体，激活大量的T细胞（包括CD4+，CD8+）并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖细胞介导的细胞毒作用。目前，超抗原的这种特性已被广泛用于抗肿瘤的研究当中。其中，葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin A SEA）是一种已有较广泛研究基础的超抗原，诸多体内和体外实验已证实其具有明显的诱发抗肿瘤免疫反应的作用。从上述超抗原作用机制可见，SEA的提呈与MHC-Ⅱ分子有极大的关系，然而并非所有肿瘤细胞都表达MHC-Ⅱ分子，且超抗原无抗肿瘤的特异性，MHC-Ⅱ类阳性的正常细胞也能成为其靶细胞而被杀伤，因此超抗原直接用于抗肿瘤有很多的限制。为了增强其对肿瘤的特异性，构建单克隆抗体与超抗原的融合蛋白使超抗原不再需要MHC-Ⅱ类分子的辅助，而通过单抗与表达相应抗原的肿瘤细胞特异性结合后，在肿瘤局部活化大量T细胞，释放多种细胞因子，杀伤肿瘤细胞，称为单抗导向的超抗原。近年来利用基因工程方法改造完整单抗得到的小分子片段如ScFv、Fab’等，保留和亲本抗体相似的活性，大大改善了完整单抗的缺点，且在基因水平上较为容易操作，已有很多研究利用SEA和ScFv构建融合蛋白并表现出显著的杀伤肿瘤细胞活性。ND-1是以人大肠癌细胞系CCL-187为免疫原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，该单抗对高中分化大肠癌组织具有高特异结合活性，利用基因工程将ND-1改造获得的小分子单链抗体ND-1ScFv已经体内外实验证实具有其亲本单抗ND-1相似的抗原特异性。在此基础上，本研究拟构建ND-1ScFv和SEA的融合基因，并在大肠杆菌中进行功能性表达，以提高SEA的大肠癌靶向杀伤作用。为大肠癌的免疫治疗提供新的途径。实验材料与方法以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板PCR扩增获得SEA基因序列，PCR产物克隆入pMD18-T vector并转化E.Coli JM109，测序鉴定单菌落；从鉴定正确的单菌落中提取质粒并以该质粒为模板PCR扩增linker-SEA序列，扩增过程中引入编码5个氨基酸（G4S）的linker序列及用于插入表达载体pQE30 ScFv的ScFv基因下游所需的SalⅠ／HindⅢ酶切位点，PCR产物克隆入T载体并转化，测序鉴定后，即获得克隆载体pMD18-T linker-SEA。以质粒pET-28a（+）ND-1ScFv为模板PCR扩增ScFv序列，引入用于将其插入表达载体pQE30的酶切位点BamHⅠ和SalⅠ。PCR产物克隆入T载体并转化，测序鉴定提取质粒即为pMD18-T ScFv。将质粒双酶切克隆入表达pQE30载体并转化E.Coli M15，从单菌落中提取质粒经相同双酶切鉴定，即获得表达载体pQE30ScFv。将质粒pMD18-T linker-SEA和pQE30 ScFv经相同的双酶切，16℃过夜连接，转化E.Coli M15，从单菌落中提取质粒双酶切鉴定，即获得融合蛋白的表达载体pQE30 ND-1ScFv-SEA。在IPTG终浓度1mM、25℃、3小时的条件下，大量诱导表达ND-1ScFv-SEA，裂解菌体收集包涵体，经变性溶解，Ni-NTA resin亲和层析柱纯化，复性；纯化后的ND-1ScFv-SEA进行SDS-PAGE测定分子量及纯度。间接免疫荧光法检测融合蛋白与CCL-187细胞的特异性结合活性，MTT法测定其对CCL-187细胞的杀伤作用。实验结果以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板PCR扩增SEA，产物经琼脂糖凝胶电泳在750bp附近显示一明显条带，与SEA理论值771bp相符。产物测序结果回报，除设计的三处定点突变外，其余序列与原序列完全一致。以质粒pMD18-T SEA为模板PCR扩增linker-SEA，产物经琼脂糖凝胶电泳在750bp附近显示一明显条带，与linker-SEA理论值726bp相符，产物测序结果回报与设计序列一致，表明带有SalⅠ／HindⅢ酶切位点的linker-SEA基因序列成功插入T载体中。以质粒pET-28a（+）ND-1ScFv为模板进行PCR扩增ScFv，产物经琼脂糖凝胶电泳在750bp附近显示一明显条带，与ScFv理论值729bp相符，测序结果回报与设计序列一致。ScFv克隆入表达载体后经双酶切鉴定，同样得到约750bp基因片段，表明带有BamHⅠ／SalⅠ酶切位点的ScFv基因序列成功插入表达载体pQE30中。质粒pMD18-T linker-SEA和pQE30 ScFv双酶切并连接，得到的重组质粒经双酶切鉴定，ScFv-SEA基因全长1443bp，电泳显示在约1500bp处呈现一明显条带，与理论值相符，表明表达载体pQE30 ND-1ScFv-SEA构建成功。阳性菌落在25℃、IPTG终浓度为1mM，培养3小时条件下大量诱导表达融合蛋白，纯化后SDS-PAGE显示蛋白分子量与预测值54KD相符，蛋白纯度为90％以上。间接免疫荧光检测显示，ND-1ScFv-SEA对表达有相应抗原的靶细胞CCL-187具有特异结合活性。MTT检测结果显示，ND-1ScFv-SEA对CCL-187有显著杀伤作用，杀伤率达到90.8％，明显增强了SEA的杀伤活性。结论本研究成功构建了超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1ScFv的融合基因ND-1ScFv-SEA并在大肠杆菌中得到高效表达，该融合蛋白具有预期的特异性识别大肠癌细胞CCL-187的活性和强大的靶向杀伤大肠癌细胞的作用，是一种很有发展前景的大肠癌免疫治疗模式。