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溴化乙啶生物毒性的纳米表征及间质干细胞骨架的研究

2020-11-22阅读(609)

溴化乙啶生物毒性的纳米表征及间质干细胞骨架的研究

论文摘要

溴化乙啶(ethidium bromide,EB)作为杂环类有机物,对生物体的损伤可以达到基因水平,具有很强的生物毒性。但是目前对EB的生物毒性还缺乏具体的实验数据证明,特别是从纳米水平来研究EB对生物大分子及细胞的损伤作用。此外,作为成体干细胞的一种,人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能,对MSCs细胞骨架及超微结构的研究有助于进一步了解其多向分化功能。 本文基于原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)的超高分辨率及无损伤成像,对EB致DNA、染色体、细胞的损伤作用进行了比较全面的研究,实现了中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞有丝分裂过程及MSCs骨架与超微结构的可视化,讨论了染色体制备过程中胰脢作用时间的差异对染色体结构的影响。 具有创新性的成果有:(1)首次从纳米水平表征了EB的生物毒性,结果表明EB不仅可以导致遗传物质DNA及染色体形态结构的损伤,还可以造成细胞膜结构的破坏,这表明EB的作用既是基因水平的,也是细胞水平的。EB对染色体及细胞的损伤作用呈剂量依赖型。在短期内,EB对细胞的作用主要表现为对细胞膜结构的破坏。(2)根据AFM对CHO细胞有丝分裂的跟踪观察结果,可将CHO细胞分裂相的中、后期分别细分为三个和两个亚期,这对传统的有丝分裂知识是一个有益的补充。(3)染色体制备过程中胰腌作用时间的不同对染色体结构影响较大,当作用时间超过30s时,染色体出现“三链”赝像。对AFM而言,作用时间在10s左右为宜,而不是用于一般显微技术观察的30s。(4)实现了MSCs细胞骨架的可视化,观察到了许多与其分化功能有密切关系的特化结构,如树枝状、鱼尾状及爬山虎脚样骨架结构和细胞伪足等,为MSCs的临床应用提供了有价值的试验数据。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 序言
  • 第一章 原子力显微镜
  • 第一节 原子力显微镜的诞生及发展
  • 第二节 原子力显微镜的构造及原理
  • 2.1 AFH的工作模式
  • 2.2 AFM成像环境及基底选择
  • 2.3 AFM的优点与缺点
  • 第三节 原子力显微镜在分子、细胞生物学研究中的应用
  • 3.1 AFM应用于分子生物学研究
  • 3.1.1 在DNA分子与染色体研究中的应用
  • 3.1.2 在蛋白分子研究中的应用
  • 3.2 AFM在细胞生物学研究中的应用
  • 第四节 展望
  • 参考文献
  • 第二章 EB对DNA、染色体及细胞损伤的研究
  • 第一节 背景介绍
  • 第二节 材料与方法
  • 2.1 DNA样品准备
  • 2.2 染色体的制备
  • 2.2.1 主要试剂
  • 2.2.2 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞染色体的制备
  • 2.2.3 （不）与EB作用的人染色体的制备
  • 2.3 细胞样品的准备
  • 2.4 AFM扫描
  • 第三节 结果与讨论
  • 3.1 与EB作用前后DNA的AFM成像结果
  • 3.1.1 未与EB作用的DNA的AFM图像
  • 3.1.2 与EB作用后的DNA的AFM图像
  • 3.2 染色体的AFM成像结果
  • 3.2.1 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞有丝分裂的跟踪观察
  • 3.2.2 与EB作用前后的染色体观察
  • 3.2.2.1 胰酶消化时间的变化对染色体结构的影响
  • 3.2.2.2 经0.1ml EB作用后的染色体
  • 3.2.2.3 经0.05ml EB作用后的染色体
  • 3.2.3 染色体制备对AFM观察的影响
  • 3.3 与印作用前后的ES细胞
  • 3.3.1 正常的ES细胞
  • 3.3.2 加EB（50μl，5.4mg／ml）后单个ES细胞
  • 3.3.3 与EB（50μl，5.4mg／ml）作用后呈Clone状贴壁生长的ES细胞团
  • 3.3.4 与EB（20μl，50μg／ml）作用后的ES细胞
  • 3.3.4.1 单个ES细胞的AFM图像
  • 3.3.4.2 克隆状生长的ES细胞团的AFM图像
  • 3.3.5 与EB（5μl，50μg／ml）作用后的ES细胞
  • 3.3.5.1 单个ES细胞的AFM图像
  • 3.3.5.2 克隆状生长的ES细胞团的AFM图像
  • 第四节 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 间质干细胞骨架与超微结构的研究
  • 第一节 背景介绍
  • 第二节 材料与方法
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 材料与试剂
  • 2.1.2 骨髓的分离及单个细胞的制备
  • 2.1.3 人骨髓间质干细胞的培养
  • 2.1.4 AFM观测成像
  • 第三节 结果与讨论
  • 3.1 对培养了1d的MSCs的AFM观察
  • 3.2 培养了5d的MSCs的AFM观察
  • 第四节 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 全文总结
  • 攻读硕士学位期间参加科研工作基本情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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