论文摘要
背景和目的：骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于骨髓的非造血干细胞，能跨越胚层限制分化为神经细胞。其既具有干细胞的一般特性，又具有取材方便、可用于自体移植、不存在伦理道德问题、易于外源性基因的转染等优点，使其具有广阔的研究与应用前景，是神经系统疾病基础研究与基因治疗较为理想的工程细胞。然而，MSC的生命周期是有限的，在体外培养的条件下，大约传代20代后即开始衰老，这一缺陷限制了对MSC的进一步研究和应用。同时，细胞衰老问题一直是医学界研究的热点，也是阻碍人类生物学和组织工程学研究的难点。目前促使细胞永生化主要是通过应用病毒、放射性因素、癌基因及原癌基因、端粒酶等手段。其中以导入外源性端粒酶逆转录酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的技术最为常见。导入hTERT可诱导端粒酶活性，使端粒保持长度稳定，细胞增殖能力增强，从而大大延长其体外培养的寿命。因此，本实验构建hTERT真核表达载体并转染MSC，为进一步建立永生化间充质干细胞系奠定基础。实验方法：1．hTERT基因的克隆从人食管癌组织中提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增得到hTERT基因，回收纯化；以T4连接酶连接hTERT基因片段和pGEM-T Easy载体，转化感受态细菌DH5 a后经蓝白筛选和以T7／SP6为引物PCR扩增筛选鉴定重组克隆。2．hTERT真核表达载体的构建接种pGEM-T-hTERT重组质粒于LB（Amp+）液体培养基，提取此重组质粒DNA并用限制性内切酶EcoRⅠ对其和pcDNA3.1质粒载体酶切，分别回收纯化，得到hTERT基因双粘片段和pcDNA3.1线性质粒。羟基化双粘pcDNA3.1并进行自身环化试验后，以T4连接酶将hTERT基因双粘片段和pcDNA3.1线性质粒连接，转化感受态细菌DH5 a。PCR正反鉴定筛选阳性重组质粒pcDNA3.1-hTERT。3．hTERT真核表达载体转染人骨髓间充质干细胞用非脂质体基因转染剂Fugene6转染重组质粒pcDNA3.1-hTERT。G418筛选阳性细胞克隆，挑选单克隆扩大再培养。结果：1．hTERT基因的克隆RT-PCR扩增得到的cDNA片段为3363bp，与GenBank中hTERT基因cDNA长度一致。hTERT基因cDNA片段与克隆载体pGEM-T Easy连接后转化，经蓝白筛选得到大量菌落，以T7／SP6为引物PCR扩增鉴定得到阳性重组克隆pGEM-T-hTERT。2．hTERT基因真核表达载体的构建酶切pGEM-T-hTERT和pcDNA3.1后得到的hTERT双粘片段及pcDNA3.1线性质粒，连接后经转化得到大量菌落，通过PCR正反鉴定得到重组质粒pcDNA3.1-hTERT。3．hTERT基因真核表达载体转染人骨髓间充质干细胞以非脂质体基因转染剂Fugene6将重组质粒pcDNA3.1-hTERT转染人骨髓间充质干细胞。G418筛选出阳性克隆，提示hTERT基因片段已整合到细胞基因组中。结论：本研究成功建立了hTERT基因克隆；成功构建了pcDNA3.1-hTERT真核表达载体；经过非脂质体介导法将其成功的转染并整合到人骨髓间充质干细胞中。为建立MSC永生化细胞系、促MSC分化等进一步研究工作奠定了坚实的基础。