类受体激酶基因StLRPK1在马铃薯晚疫病抗性中的作用

论文摘要

同致病卵菌Phytophthora infestans引起的晚疫病是马铃薯的毁灭性病害,对马铃薯生产造成严重的经济损失。本实验室前期克隆了一个晚疫病菌诱导表达的马铃薯类受体激酶基因StLRPK1,该基因在烟草中超量表达能够提高晚疫病抗性。本实验利用基因超量表达和干涉技术、启动子顺式作用元件分析技术,进一步研究了StLRPK1在马铃薯抗晚疫病抗性中的作用,主要结果如下：1.克隆了StLRPK1基因长度为2338 bp的启动子区域。通过启动子预测软件PLACE在线预测,表明在2338 bp区域内表明除基本启动子元件外,还存在与抗病、激素诱导、逆境胁迫信号和器官特异性表达相关元件。构建了启动子和GUS报告基因的融合载体,农杆菌转化获得10株普通烟草转基因株系。2.构建了绿色荧光融合表达载体pFF19-StLRPK1-GFP,采用基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞。激光共聚焦显微镜观察的结果显示绿色荧光主要分布于细胞膜,而对照绿色荧光均匀分布于整个细胞,表明StLRPK1定位在膜上行使功能。3.构建了StLRPK1超量和干涉表达载体,农杆菌转化分别获得鄂马铃薯3号（E3）转基因超量表达株系13株,干涉表达株系10株。利用Realtime-PCR对已获得的StLRPK1基因超量和干涉转基因株系基因表达量进行了检测,表明不同转基因株系表达量存在较大差异。其中超量表达株系最高为对照47.8倍,干涉株系干涉效率最高为96%。4.转基因植株抗病、耐盐性鉴定。选择超量表达和干涉沉默效率高的株系进行了离体晚疫病接种鉴定。结果显示超量表达株系的病斑扩展速率明显小于对照病斑扩展速率,干涉株系的病斑扩展速率明显大于对照的病斑扩展速率,表明StLRPK1参与了马铃薯晚疫病抗性,是研究马铃薯晚疫病水平抗性的一个重要候选基因。150 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,E3、超量和干涉株系试管苗生长量均受到明显抑制,但干涉株系比超量株系更为严重,说明StLRPK1在盐胁迫反应中也可能起到一定作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 晚疫病概述
• 1.1.1 病原菌及危害症状
• 1.1.2 晚疫病的防治
• 1.2 马铃薯晚疫病抗性机制
• 1.2.1 R基因介导的垂直抗性
• 1.2.2 水平抗性
• 1.2.3 马铃薯晚疫病抗病分子生物学研究进展
• 1.3 富含亮氨酸重复类受体激酶（LRR-RLKs）研究
• 1.3.1 LRR-RLKs结构和类型
• 1.3.2 LRR-RLKs的功能
• 1.3.2.1 调节植物生长发育
• 1.3.2.2 LRR-RLKs与植物抗病
• 1.4 植物基因功能研究方法
• 1.4.1 超量表达目的基因的方法
• 1.4.2 干涉技术
• 1.4.3 基因启动子研究
• 1.4.4 亚细胞定位
• 1.5 本课题的研究目的和意义
• 第二章 StLRPK1基因启动子的克隆及亚细胞定位
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料、菌株、载体及试剂
• 2.1.2 StLRPK1基因启动子的克隆
• 2.1.3 StLRPK1基因启动子与GUS载体构建
• 2.1.4 普通烟草的遗传转化
• 2.1.5 StLRPK1基因与GFP融合载体构建
• 2.1.6 基因枪转化洋葱表皮细胞
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 StLRPK1基因启动子的克隆
• 2.2.2 StLRPK1基因启动子序列顺式作用元件的分析
• 2.2.3 StLRPK1基因启动子与GUS融合载体构建
• 2.2.4 pBI-pStLRPK1-GUS转基因的获得及PCR检测
• 2.2.5 StLRPK1基因与GFP融合表达载体的构建
• 2.2.6 PFF19-StLRPK1-GFP亚细胞定位
• 2.3 小结
• 第三章 StLRPK1基因抗晚疫病功能初探
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料、菌株、载体及试剂
• 3.1.2 质粒小量抽提DNA
• 3.1.3 StLRPK1基因干涉表达载体的构建
• 3.1.4 马铃薯试管薯的获得及遗传转化
• 3.1.5 转基因株系小量法抽提DNA及PCR检测
• 3.1.6 转基因株系小量法抽提RNA
• 3.1.7 RNA纯化及反转录
• 3.1.8 荧光实时定量PCR检测转基因株系目标基因表达量
• 3.1.9 晚疫病原菌的繁殖
• 3.1.10 晚疫病原菌的接种
• 3.1.11 荧光实时定量PCR检测病斑菌丝生长量
• 3.1.12 转基因株系盐胁迫处理
• 3.1.13 数据统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 StLRPK1基因干涉表达载体的构建
• 3.2.2 马铃薯遗传转化
• 3.2.3 StLRPK1基因超量和干涉转基因株系PCR鉴定
• 3.2.4 荧光实时定量PCR检测转基因株系目标基因表达量
• 3.2.5 StLRPK1基因超量和干涉转基因株系田间表型变化
• 3.2.6 StLRPK1基因超量和干涉转基因株系晚疫病抗性鉴定
• 3.2.7 StLRPK1基因转基因株系耐盐性分析
• 3.3 小结
• 第四章 讨论
• 4.1 StLRPK1基因启动子分析和亚细胞定位
• 4.2 StLRPK1基因功能初步分析
• 4.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢