小麦春化及光周期相关基因SNP等位变异的Ecotilling分析

论文摘要

春化作用特性、光周期反应特性是小麦的重要农艺性状,直接影响小麦品种的利用、种植区划、引种及栽培技术,并且还间接影响产量、抗病、抗逆等许多重要的农艺性状,研究小麦的春化特性、光周期特性对引种、育种和栽培管理都具有重要意义。Ecotilling是检测生物自然群体相关基因等位变异的高通量反向遗传学研究方法,能够快速有效的识别出目的基因的差异位点。因此,将Ecotilling用于对春化基因和光周期基因的研究,有助于我们更加深入的了解小麦抽穗开花的分子调控机制及各基因存在的等位变异,为通过分子育种方法来改良小麦生育期性状提供参考。本研究优化了传统的Ecotilling技术,采用琼脂糖凝胶电泳检测Ecotilling的酶切片段,达到了较为满意的效果。并用琼脂糖凝胶Ecotilling技术对部分小麦材料中春化基因VRN-A1及光周期基因Ppd-D1相关区域存在的等位变异进行了检测,分析了目的片段中的SNP及其与性状的关系。主要结果如下:（1）初步建立了以琼脂糖凝胶检测为核心的Ecotilling技术体系。在验证CELⅠ具有较好活性的基础上,对以荧光检测技术为基础的Tilling/Ecotilling技术进行改进,用含有错配碱基的两种阳性质粒构建杂合双链,然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,建立了琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的Ecotilling技术体系。（2）以小麦春化基因VRN-A1为参照优化了小麦Ecotilling技术体系的具体参数。结果表明,对于多倍体物种,酶切片段的量是检测的关键,当DNA池构建的供试材料与对照的比例为1:1、反应体系含DNA模板160ng、酶用量2.4μL /体系、切割时间45 min、2%琼脂糖凝胶电泳时,Ecotilling酶切片段检测结果较好,为应用琼脂糖凝胶Ecotilling技术检测小麦基因的SNP等位变异奠定了基础。利用建立的琼脂糖凝胶Ecotilling技术,对108份小麦品种的春化作用相关基因VRN-A1的SNP等位变异进行了检测。结果表明,根据酶切带型可将参试材料分为A、B、C三种单倍型,其中,A单倍型存在6处变异,B单倍型存在5处变异,C单倍型存在3处变异,测序表明这些变异包括单碱基的转换、颠换、缺失、以及小片段的插入。各单倍型材料的冬春性分析结果表明,A和B两种单倍型与品种的冬性表型有关,而C单倍型与品种的春性表型有关。并发现了3个调控小麦冬春性表型转变的关键位点的SNP等位变异。（3）采用建立的琼脂糖凝胶Ecotilling技术,对108份小麦品种的光周期基因Ppd-D1核心编码区的SNP等位变异进行了检测。结果发现,小麦农家种红芒麦、红芒麦2和宁春27可归为同一单倍型,都有三条相同的特异性酶切条带,其序列与对照相比,存在两处单碱基突变（C/T;G/A）;坝农1号、定西35、QW6285等7份材料可归为另一种单倍型,呈现出两条特异的酶切条带,其序列与对照相比含有一个5bp的缺失;其余材料与对照相比则没有发生突变。初步分析表明,这三处SNP与小麦光周期敏感性没有明显关联,其与抽穗期的关系还需进一步分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦春化作用及光周期研究
• 1.1.1 小麦春化作用及光周期研究的意义
• 1.1.2 小麦春化作用及光周期相关基因的研究概况
• 1.2 Tilling/Ecotilling 研究概况
• 1.2.1 SNP 在作物研究中的应用
• 1.2.2 Tilling/Ecotilling 技术的主要原理与方法
• 1.2.3 Tilling/Ecotilling 在作物中的应用
• 1.3 研究目的及技术路线
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 技术路线
• 第二章 琼脂糖Ecotilling 技术体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 芹菜CEL I 粗酶的提取方法
• 2.1.3 CELⅠ酶活性检测
• 2.1.4 琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 CELⅠ活性检测
• 2.2.2 酶切片段的琼脂糖电泳检测
• 2.3 讨论
• 第三章 小麦春化相关基因VRN-A1 的Ecotilling 分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 DNA 池的构建
• 3.1.3 特异性引物的设计、验证
• 3.1.4 PCR 扩增及杂合双链的形成
• 3.1.5 杂合产物的酶切及琼脂糖电泳检测
• 3.1.6 测序验证及基因分型
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 引物的特异性鉴定
• 3.2.2 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测及基因分型
• 3.2.3 Ecotilling 结果的测序验证
• 3.3 讨论
• 3.3.1 小麦VRN-A1 基因的等位变异与其冬春性
• 3.3.2 Ecotilling 技术的应用
• 第四章 小麦光周期基因Ppd-D1 的Ecotilling 分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 特异性引物的设计、筛选
• 4.1.3 PCR 扩增及杂合双链的形成
• 4.1.4 酶切片段的琼脂糖电泳检测
• 4.1.5 Ecotilling 特异材料相关基因的测序
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 引物的特异性鉴定
• 4.2.2 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测及突变预测
• 4.2.3 测序结果与 Ecotilling 分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 光周期基因等位变异与小麦的抽穗开花期
• 4.3.2 待检基因目标区段的选择
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介