论文摘要
种公牛的精液品质对牛群的发展和品质改良起着极其重要的作用。尤其在人工授精和冷冻精液日益普及的今天,种公牛的作用更为重要。但种公牛的精液品质是受多基因控制的数量性状,通过常规育种方法选择周期长,效率低。随着分子生物学技术在动物育种上的应用,可对目的动物实现早期选择,显著提高选种效率。本研究选择与精子成熟及运动相关的SPAG11和Tf基因作为候选基因,以全国三大公牛站北京、上海和山东434头存栏公牛作为试验材料,通过PCR-SSCP,PCR-RFLP和DNA测序等方法检测SPAG11基因和TF基因中单核苷酸多态性（SNPs）位点,并分析这些SNPs位点及其不同单倍型与荷斯坦公牛的精液品质性状的关联性,筛查影响公牛精液品质性状的相关分子标记,为未来培育高繁殖性能的公牛提供参考依据。一.SPAG11基因多态性与公牛精子性状关联性分析精子相关抗原11（Sperm-Associated Antigen 11,SPAG11）是β-防御素的一种,主要在哺乳动物的附睾和雄性生殖道中表达,参与雄性生殖道的先天免疫,在附睾中参与精子的成熟,此外还参与透明带的识别和精卵结合等事件。本试验扫描了SPAG11基因,发现了6个新SNPs位点,分别为g.1306G>A, g.1454G>A,g.16904G>T, g.16974C>T, g.17000A>G和g.22696T>C,均为首次报道的位点,且均已递交至NCBI, SNPs登录号分别为ss 289574502,ss 289574504,ss 289574505,ss 289574507,ss 289574508和ss 289574509。其中g.1306G>A, g.1454G>A突变产生了PsyI和PstI的识别位点,2个位点的酶切多态性在所研究群体中是紧密连锁的;2个位点的G、A等位基因在群体中都有分布,且处于中度多态;G和A等位基因的频率分别为79.63%和20.37%;GG,GA和AA基因型频率分别为63.70%,31.85%和4.45%;χ2适合性检验表明,该群体在这2个位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;这三种基因型对公牛精液性状均无显著影响（P>0.05）。g.16904G>T, g.16974C>T, g.17000A>G 3个位点采用PCR-SSCP技术进行基因分型,3个位点在所研究的群体中首次证明是紧密连锁的。EE基因型个体鲜精密度极显著高于DE基因型个体（P<0.01）,EE和DD基因型个体鲜精活力显著高于DE基因型个体（P<0.05）。g.22696T>C位点采用创造酶切位点的方法,产生了一个Eco72I酶切位点,酶切分型发现该位点在试验群体中只存在两种基因型,且TC基因型个体较TT基因型个体有高的精子冻后活力（P<0.05）和高的畸形率（P<0.01）。SPAG11基因的6个多态位点单倍型组合分析表明:共构建出8种单倍型,发现了17种单倍型组合;其中H5H6（GGT/TTC）单倍型组合个体采精量最高;H1H1（AAT/TTT）单倍型组合个体鲜精活力最高:H1H6 （AGT/TTC）单倍型组合个体精子冻后活力最高。上述单倍型组合可为高繁殖性能的公牛早期培育提供参考依据。二.Tf基因多态性与公牛精子性状关联性分析转铁蛋白是高等脊椎动物体内主要的铁离子结合蛋白,通过体液循环将三价铁离子从吸收部位运输到所需部位。睾丸Tf含量对精子的生成和发育有影响作用。根据NCBI的登录号ss 250608649、ss 250608650和ss250608651,经测序,在本试验群体公牛个体中也证实存在-1748G>A、13942T>C和14037 A>G 3个SNPs,分别位于5’调控区、外显子8和内含子8区。与精子性状的相关性分析表明:13942T>C三种基因型间CC个体精子畸形率显著低于TT个体（P<0.05）。-1748G>A和14037 A>G突变位点不同的基因型对精子性状均无显著性影响（P>0.05）。Tf基因3个多态位点单倍型组合分析表明:共构建出6种单倍型,发现了14种单倍型组合;其中H3H3（GAT/GAT）单倍型组合个体采精量和体鲜精密度最高;H1H1（AAT/AAT）单倍型组合个体鲜精活力和精子冻后活力最高。上述单倍型组合可为高繁殖性能的公牛早期培育提供参考依据。研究了Tf mRNA在公牛6种不同组织中的表达量,结果显示Tf mRNA在公牛肝脏中的水平最高,睾丸中的水平比肾脏、脾脏和肺中的水平高。