猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立

论文摘要

猪支原体肺炎（Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引起猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性接触性呼吸道传染病。主要症状及表现为咳嗽、气喘、饲料的利用率低,病猪生长十分缓慢,甚至生长停滞。该病以发病率高,死亡率低为其特点。而在临床上检测感染猪,仍面临困难。猪肺炎支原体的表面膜蛋白是该菌主要的免疫抗原,对猪肺炎支原体感染的诊断有重要意义。本研究通过制备抗猪肺炎支原体高免血清,运用辛酸-硫酸铵盐析和阴离子交换层析技术,获得高活性、高电泳纯的IgG。再将纯化IgG与CNBr-activated Sepharose4B偶联制得抗Mhp—免疫亲和层析柱,以提取和纯化通过TritonX-100结合KI破碎的支原体细胞所获得的猪肺炎支原体膜蛋白。纯化的膜蛋白抗原经SDS-PAGE电泳分析,结果显示,纯化后的抗原蛋白分子的纯度显著提高,仅呈现66KD,48KD,46KD,40KD,32KD和24KD的6条清晰的蛋白条带,而未纯化的膜蛋白条带有11条,分子量范围在20KD-100KD之间。本研究采用纯化的膜蛋白抗原建立了猪肺炎支原体的间接ELISA检测方法。试验确定的最适ELISA工作条件为:包被纯化抗原蛋白浓度5ug/ml,血清稀释度为1:80,封闭液为1.5%BSA,封闭时间120min,抗原抗体作用时间90min,酶标二抗SPA（1:1000稀释）作用时间为60min,阴阳性界限OD值为0.289。分别用纯化抗原和粗提抗原包被ELISA板,对比二者的检测结果发现,纯化抗原对样品的阳性检出率比粗提抗原提高了7.5%。用建立的标准猪肺炎支原体ELISA检测方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试剂盒同时检测50份血清样品,二者总的符合率为92%。对临床送检的150份不同年龄段的猪血清样品,用该ELISA方法检测,结果显示,断奶前仔猪Mhp感染率为44.2%,保育猪为41.2%,育肥猪为17.9%。检测结果说明,猪肺炎支原体在猪群中广泛存在,也证明了建立的猪肺炎支原体ELISA检测方法在临床诊断中具有重要的实用价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 猪肺炎支原体及其危害性概述
• 1.2 猪肺炎支原体的致病机理
• 1.2.1 猪肺炎支原体荚膜致病性的研究
• 1.2.2 猪肺炎支原体细胞膜致病性的研究
• 1.3 猪肺炎支原体抗原蛋白的研究
• 1.4 猪肺炎支原体诊断方法的研究进展
• 1.4.1 临床与病理组织学诊断
• 1.4.2 病原学诊断检测
• 1.4.3 血清学检测
• 1.4.4 分子生物学诊断检测
• 1.5 本研究的目的意义
• 2.试验材料
• 2.1 试验菌株、动物及血清
• 2.2 SDS-PAGE相关溶液
• 2.3 ELISA相关溶液
• 2.4 亲和层析相关溶液
• 2.5 猪肺炎支原体培养基的制备
• 2.6 主要仪器设备
• 2.7 主要试剂
• 3.试验方法
• 3.1 菌株培养及膜蛋白提取
• 3.1.1 猪肺炎支原体的培养
• 3.1.2 猪肺炎支原体膜蛋白的粗提取
• 3.2 猪肺炎支原体免疫血清的制备
• 3.3 猪肺炎支原体免疫血清的纯化
• 3.3.1 免疫血清IgG的辛酸-硫酸铵盐析粗提
• 3.3.2 应用High-Q阴离子交换层析对免疫血清的纯化
• 3.4 膜蛋白的免疫亲和纯化
• 3.4.1 免疫亲和柱的制备
• 3.4.2 免疫亲和纯化膜蛋白
• 3.5 猪肺炎支原体抗体检测ELISA方法的研究
• 3.5.1 用纯化蛋白作为包被抗原的ELISA方法
• 3.5.2 ELISA试验条件的确定
• 3.5.3 ELISA阴阳界限的确定
• 3.5.4 ELISA的交叉反应试验
• 3.5.5 纯化抗原与粗提抗原ELISA检测的比较
• 3.5.6 ELISA方法敏感性和特异性的检测
• 3.5.7 ELISA方法的重复性试验
• 3.5.8 ELISA方法的临床检测
• 4.试验结果
• 4.1 免疫血清的纯化及鉴定
• 4.2 膜蛋白的免疫亲和纯化
• 4.2.1 亲和层析柱的制备
• 4.2.2 膜蛋白的纯化
• 4.3 ELISA检测方法的研究
• 4.3.1 抗原蛋白最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定
• 4.3.2 封闭液和封闭时间的确定
• 4.3.3 抗体作用时间的确定
• 4.3.4 酶标SPA作用时间的确定
• 4.3.5 ELISA阴阳界限的确定
• 4.3.6 ELISA的交叉反应试验
• 4.3.7 纯化抗原与粗提抗原ELISA检测的比较
• 4.3.8 间接ELISA方法与IHA的比较
• 4.3.9 间接ELISA的重复性试验
• 4.3.10 间接ELISA的临床检测
• 5.分析讨论
• 5.1 免疫血清IgG的纯化
• 5.2 猪肺炎支原体膜蛋白的提取
• 5.3 膜蛋白的免疫亲和层析
• 5.4 间接ELISA试验方法研究
• 5.5 临床检测
• 6.结论
• 参考文献
• 致谢