论文摘要
脊柱融合术被广泛应用于退行性病变、创伤、肿瘤等各种脊柱疾患的治疗中,是脊柱外科手术中最常用技术之一。但仍有最多高达45%的患者发生假关节形成,同时自体髂骨植骨增加了手术创伤并带来了相关并发症。进一步提高脊柱融合率和寻找更为合适的移植替代物,成为脊柱外科的研究热点。在对成骨的分子机制的研究过程中,逐渐发现了一系列生物因子对诱导成骨细胞分化和促进局部骨形成有着重要的作用,这些因子被称为骨诱导因子。许多骨诱导因子被发现、研究并应用于脊柱融合术。BMPs是现在研究最多的骨诱导生长因子。研究证实rhBMP-2的应用增加了脊柱融合几率并减少了自体骨移植所带来的手术创伤。但rhBMP-2价格昂贵并有明确的剂量依赖性,常需要使用毫克级别的重组蛋白才能达到满意的临床疗效。LIM矿化蛋白（LIM mineralization protein, LMP）是近期发现的诱导成骨细胞分化成熟的胞内细胞信号因子,可促进成骨细胞分化和骨形成,在骨的矿化过程中发挥重要作用。研究证实,LMP体外和体内可以诱导多种细胞内BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7以及TGF-β等多种骨诱导因子的分泌,同时提高成骨相关细胞对外源性BMPs的反应性,招募周围细胞参与成骨。相关对比研究发现,在诱导体内异位成骨和脊柱融合的动物实验中,LMP-1的效能强于BMP-2。将LMP作为目的基因的局部基因治疗中发现:不需要转染每一个受体细胞,也不需要长时间的表达就可以产生较强的成骨效应,故LMP较BMPs等更适合于脊柱融合的治疗。上述研究表明LMP-3和LMP-1可以作为BMPs类理想的替代物,有望避免了大剂量单一应用BMPs的不便之处,并产生更大的诱导成骨效应。迄今已分离出3种LMP基因型,Boden等对LMP同源蛋白的结构和功能进行了系列研究,发现:hLMP-1长457个氨基酸,包含1个PDZ功能区（N端）和3个LIM功能区（C端）,hLMP-2长423个氨基酸,包含完整的PDZ功能区和LIM功能区,hLMP-3长153个氨基酸,包含1个完整PDZ功能,LIM功能区缺失。研究证实,hLMP-2拥有完整的LIM功能区但没有促进成骨作用,hLMP-3没有LIM功能区却具备与hLMP-1类似的诱导成骨能力。对LMP的分析揭示:LMP-1和LMP-3共有一个40aa的独特区域显示出与成骨作用密切相关。LMP作为胞内信号转导分子,目前均采用质粒、腺病毒等基因治疗的方式导入编码cDNA以过度表达的方式实现其研究和应用。基因治疗导入效率偏低,且存在安全问题,有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。构建具有入胞转导能力并保持成骨活性的LMP重组蛋白,有望大大拓宽LMP的应用范围,并使LMP的实际临床应用成为可能。1988年Green和Frankle发现人免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活蛋白（tat）能介导自细胞外转运至细胞内的跨膜转运,后续对tat蛋白的结构研究发现tat49-57（RKKRRQRRR）9肽序列是其主要功能区,也是保持tat蛋白功能活性的最小片断。在分子生物学和细胞生物学的研究中,陆续发现了一系列短肽具有相似的跨膜转运功能,这类短肽被统称为蛋白转导域（protein transduction domains,PTDs）。PTD转导技术可介导包括蛋白在内的多种生物大分子的转运,且不受细胞类型的限制,并有望保持被转运分子的生物活性,在生物细胞学研究和药物开发等领域有着广泛的应用前景。PTD介导的入胞转导存在明显的优势:（1）PTD能快速有效的将携带物质跨膜转运;（2）对活体细胞干扰小,绝大部分PTD复合物在一定浓度内基本无毒性;（3）应用上操作简单,转导效率高,大多情况下能保持携带物质的生物学活性,低浓度即可发挥有效生物学效能。如前所述, TatPTD具有高效的蛋白转导的作用,我们设想将tat49-57 （RKKRRQRRR）9肽序列与LMP-3进行连接,构建TAT/LMP-3融合蛋白,利用TatPTD将LMP-3介导进入靶细胞内。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化的潜能,是组织工程常用的种子细胞,其本身亦可向成骨细胞分化,具有来源广泛、取材方便、增殖和分化能力强、能与宿主骨良好结合的优点。本实验中采用重组蛋白与人MSCs共培养的方法来验证Tat序列诱导入胞的能力和TAT/LMP-3融合蛋白促成骨分化的活性。同时,我们制备重组蛋白LMP-3作为对照。本课题的研究主要包括以下三个部分,所用到的主要方法及结果如下:第一部分TAT/LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备1.人工合成针对大肠杆菌表达体系优化的LMP-3编码基因序列,通过PCR方法分别获得TAT/LMP-3融合基因和LMP-3基因并引入酶切位点。通过酶切、连接构建原核表达载体,命名为pET43.1a-TAT/LMP-3和pET43.1a- LMP-3。测序结果提示无PCR引起的突变,基因无移码,质粒构建成功。2.将构建载体于BL21（DE3）工程菌中进行原核表达,优化表达条件后目的蛋白表达以可溶性表达为主,将表达产物上清经Ni-NTA树脂纯化后,获得重组蛋白TAT/LMP-3和LMP-3,纯度均在90%以上。3.将重组蛋白LMP-3免疫家兔获得多抗血清,经饱和硫酸铵法纯化获得多克隆抗体。ELISA法检测其对TAT/LMP-3和LMP-3的效价均在1:4000以上,western-blot分析提示抗体与重组蛋白有较好的抗原抗体反应性和一定特异性。第二部分人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定1.本部分实验中通过梯度离心法结合贴壁培养法分离获得人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,流式细胞仪分析第三代hMSCs细胞表面标志表达情况,结果阳性表达CD29、CD105,CD34和CD45表达为阴性,细胞纯度达到95%以上。2.在成骨诱导培养液（含地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L）诱导下,hMSCs碱性磷酸酶活性增高,免疫细胞化学染色检测到hMSCs内骨钙素阳性表达。14d后茜素红S染色提示钙结节形成,证实hMSCs在适当条件可诱导分化为成骨细胞。第三部分TAT/LMP-3融合蛋白诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究1.将TAT/LMP-3和LMP-3分别与人骨髓间充质干细胞共孵育,通过间接免疫荧光染色和western-blotting技术检测重组蛋白的入胞效应。结果TAT/LMP-3能以浓度/时间依赖的方式,高效快速的转导进入细胞。对照蛋白LMP-3不具备入胞转导能力。2.将纯化重组蛋白分别与人骨髓间充质干细胞共孵育,检测重组蛋白对人骨髓间充质干细胞的成骨分化诱导效能。结果提示: 100ng/ml的TAT/LMP-3与hMSCs共孵育,可诱导人骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素等成骨细胞标志基因的表达,培养14天后可观察到钙结节形成。半定量RT-PCR提示,与TAT/LMP-3共孵育后,人骨髓间充质干细胞BMP-2,4,6,7基因水平表达上调。
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标签：矿化蛋白论文; 蛋白转导域论文; 重组融合蛋白质论文; 人骨髓间充质干细胞论文; 诱导成骨论文;