论文摘要
奶山羊的泌乳在整个泌乳期具有规律性，在泌乳初期泌乳量较低，随后逐渐升高达到高峰期并维持一定时间，随着泌乳的不断进行，泌乳量将逐渐下降直至干乳期。因此，了解奶山羊乳腺发育和泌乳规律，利用分子手段改善奶山羊泌乳遗传性能，以延长奶山羊的泌乳期或提高泌乳量。目前，对奶山羊泌乳规律的研究主要采用候选基因法，并发现了大量与泌乳相关的候选基因，但其参与泌乳规律的调控机制仍不清楚。MicroRNA是一类长度约22nt的非蛋白编码的RNA，在动物的进化过程中高度保守且具有表达的时空特异性，能在转录后水平调控其靶mRNA的表达，广泛参与了细胞的增殖、分化与凋亡以及器官的发育等众多生物学过程。乳腺的发育与泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡的同期性过程。有研究表明miRNA在乳腺发育不同时期呈现差异表达模式，是乳腺发育与泌乳的重要调控因子。本研究以5只崂山奶山羊在不同泌乳时期的乳腺组织为研究材料，分别构建了泌乳初期（产后20天），泌乳高峰期（产后90天）和泌乳末期（产后210天）三个小RNA文库，采用Illumina/Solexa高通量测序技术对构建的三个文库分别进行测序，并对测序数据进行了质量检测和长度分布统计，基因组定位及小RNA分类注释，筛选出了在三个文库中差异表达的miRNA。采用生物信息学方法进一步对差异表达的miRNA进行靶基因预测、基因功能注释和KEGG通路分析。通过Solexa高通测序分析，我们发现miR-143在不同泌乳时期具有高表达丰度且呈现差异表达模式，生物信息学分析表明：其靶基因参与了乳腺的发育、细胞生长等生物学过程，采用双荧光素酶报告基因分析系统和qRT-PCR对miR-143及其潜在靶基因IGFBP5进行了靶向调控关系研究，采用MTT法、荧光Hoechst/PI双染和流式细胞术研究了miR-143对乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响。主要研究结果如下：（1）通过Solexa高通量测序，在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末期三个文库中分别获得18,031,615、19,044,002和7,385,833纯净序列读数，分别占到其高质量读数的97.88%、98.45%和73.87%。（2）小RNA长度分布统计结果表明：三个文库中小RNA序列主要分布在19-24nt之间，22nt序列最多，在三个文库中分别占到44.04%、41.48%和33.96%，其次为20nt和23nt。不同片段长度的小RNA在三个文库中呈现差异分布。（3）绵羊基因组定位分析结果表明：在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末期三个文库中分别有44,928种序列（9,093,530条读数）、69,244种序列（8,941,279条读数）和32,509种序列（3,916,179条读数）定位到绵羊基因上，分别占总序列的50.43%、46.95%和53.02%。（4）三个文库中共发现已知miRNA336个，189个呈现显著差异表达，表达丰度在1,000,000以上的有5个，let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a；在100,000-1,000,000的有10个，miR-30e-5p、 miR-30d、 miR-30a-5p、miR-21、miR-200c、miR-146b、miR-126、miR-103、let-7f、let-7c。三个库中共同表达的有289个，在两个文库中共同表达的有26个，仅在一个文库中表达的有21个，其中仅在泌乳初期表达7个，仅在泌乳高峰期表达8个，仅在泌乳末期表达6个。（5）差异表达miRNA生物信息学分析表明：对189个差异表达miRNAs采用TargetScan进行靶基因预测，共获得10,325个非冗余的靶基因。通过Blast2GO和DAVID分析，有9,341个基因在GO数据库获得了功能注释，FDR<0.05的GO注释为1,229条，显著富集的通路有68个（P<0.05）。富集到了MAPK signaling pathway、Wnt signalingpathway、Insulin signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等与泌乳有关的信号通路。（6）三个文库中共发现50个新miRNA，对其进行生物信息学分析表明：共获得13,298个靶基因EST序列，125,846条GO注释，参与了237条通路。显著富集到Metabolicpathways、ECM-receptor interaction等与泌乳有关的通路。（7）qRT-PCR分析了miR-143及其潜在靶基因IGFBP5在三个泌乳时期的表达特征，结果表明miR-143与IGFBP5在不同泌乳时期乳腺组织表达趋势相同，均在泌乳高峰期低表达。通过构建miR-143真核表达载体，野生型和突变型IGFBP5双荧光素酶报告基因载体，体外转染奶山羊乳腺上皮原代细胞，发现miR-143靶向IGFBP53′-UTR，并正向调控其表达。（8）MTT法、荧光Hoechst33342/PI双染和流式细胞术检测miR-143对乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响，结果表明：miR-143延缓了乳腺上皮细胞周期进程，可抑制乳腺上皮细胞的增殖（P<0.05），并促进其凋亡。（9）miR-143过表达后，与对照组相比凋亡基因BAX表达显著升高（P<0.01），抗凋亡基因BCL-2表达降低。