九孔鲍鲍苗致病菌及潜在生物防治的研究

论文摘要

随着鲍鱼养殖业的发展，集约化程度的提高，各种病害越来越频繁发生并愈演愈烈。成鲍病害的问题尚未得到解决，鲍苗掉板的问题又出现了。为解决此问题，在防治疾病中使用了各种抗菌剂、抗生素和各种化学药剂消毒。但这些防治手段都只是暂时性的，会导致整个生态系统的细菌耐药性不断增强，反而造成更大的危害。而且滥用抗生素使鲍苗免疫力很差，对外部环境条件骤变极不适应，容易因环境突变或应激性环境条件造成感染或并发症进而导致大量死亡现象。基于以上原因，本文从导致九孔鲍鲍苗病害的养殖池中（包括水、藻膜和变白鲍苗）分离得到了124株菌，并对其进行了生理生化分析、菌株鉴定、药物敏感性和胞外产物的测试，在此基础上完成了回归感染试验以确定致病菌。同时寻求采用生物防治的手段来防治病害，初步分离了4株蛭弧菌并对其生长和裂解致病菌的特性进行了研究。以期环保的、有效的消除和防治鲍苗病害。通过对分离得到的124株菌的研究表明，有58％、53％、44％和26％的菌株分别具有分泌胞外水解酪蛋白酶、明胶酶、脂肪酶和溶解血细胞的能力。综合以上因素，本试验从124株菌中筛选出35株作为潜在的致病菌对其进行进一步的研究。经革兰氏染色后，分离得到的35株菌中，除了菌株7和14为革兰氏阳性菌之外，其它33株菌均为革兰氏阴性菌，占总数的94.3％。所选定的35株菌主要由溶藻弧菌Vibrio alginolyticus，霍乱弧菌Vibrio cholerae，副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus，腐败希瓦氏菌属Shewanella putrafaciens等组成。其中弧菌Vibrio 17株，约占总分离菌株的50％，而溶藻弧菌Vibrio alginolyticus则为弧菌的优势菌株，有11株，约占弧菌总数的70％。在最后确定的这35株菌中，能产生胞外酪蛋白酶、明胶酶、脂肪酶和溶血素的比例分别为82.9％、94.3％、77.1％和85.6％。其中，除11、13、21和26外，其余13株弧菌均能同时产生上述三种胞外酶。同时，有16株菌在Tlh-PCR试验中呈阳性，其中有8株是弧菌，此16株菌经检验都会产生溶血毒素，因此引发溶血现象的最有可能是Tlh所编码的溶血磷脂酶。在分析弧菌中的优势菌溶藻弧菌时发现，能同时分泌三种胞外酶的菌株比例高达81.8％（9／11株），而具有Tlh基因的则占弧菌总数的63.6％（7／11株）。从本试验可以看出，在导致鲍苗病害的潜在致病菌中，弧菌特别是溶藻弧菌可能就是关键致病菌。将分离的35株菌做鲍苗感染试验，结果表明其在不同程度上都会导致鲍苗的死亡，确证其为致病菌。其中菌种1、3、5、6、10～13，15和16为主要致病菌，

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摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 引言

1.2 鲍鱼的分类、分布、生活史及其养殖方式

1.2.1 鲍鱼的分类及其主要种类的形态

1.2.2 鲍鱼的分布

1.2.3 鲍鱼的生活史

1.2.4 鲍的养殖方式

1.3 鲍鱼养殖国内外的研究概况

1.3.1 鲍鱼饲料研究进展

1.3.2 鲍鱼病害研究进展

1.4 微生物制剂

1.4.1 概念

1.4.2 微生物制剂的作用

1.5 蛭弧菌国内外的研究概况

1.5.1 蛭弧菌的分类、分布及其生理学特征

1.5.2 蛭弧菌生长史

1.5.3 蛭弧菌的应用

1.6 本课题研究的立题背景、研究意义和主要研究内容

1.6.1 本课题研究的立题背景、研究意义

1.6.2 主要研究内容

参考文献

第二章细菌的分离纯化及其胞外产物的分析

2.1 引言

2.2 材料设备与方法

2.2.1 主要试剂与材料

2.2.2 主要仪器

2.2.3 样品的采集

2.2.4 培养基

2.2.5 细菌分离

2.2.6 胞外蛋白酶

2.2.7 胞外脂肪酶

2.2.8 溶血素的测定

2.2.9 溶血基因的分析

2.3 实验结果与分析

2.3.1 细菌胞外蛋白酶

2.3.2 细菌胞外脂肪酶

2.3.3 细菌溶血素

2.3.4 潜在致病菌的选定及其分析

2.3.5 PCR扩增

2.4 本章小结

参考文献

第三章潜在致病菌的鉴定分析

3.1 引言

3.2 材料设备与方法

3.2.1 主要试剂与材料

3.2.2 主要仪器

3.2.3 菌株来源

3.2.4 培养基

3.2.5 革兰氏染色

3.2.6 生长曲线的测定

3.2.7 菌株鉴定

3.3 实验结果与分析

3.3.1 革兰氏染色结果及镜检形态

3.3.2 生长曲线

3.3.3 生理生化特点

3.3.4 细菌的分类和种群组成

3.4 本章小结

参考文献

第四章导致鲍苗病害的致病菌

4.1 引言

4.2 材料设备与方法

4.2.1 主要试剂与材料

4.2.2 主要仪器

4.2.3 实验菌株

4.2.4 试验用鲍苗

4.2.5 培养基

4.2.6 Bouin’S固定液

4.2.7 回归实验

4.2.8 病理组织切片的制备

4.2.9 苏木精-伊红（HE）染色法

4.3 实验结果

4.3.1 鲍苗病症

4.3.2 回归感染实验

4.3.3 组织病理学

4.4 讨论

4.5 本章小结

参考文献

第五章菌株抗药性的研究

5.1 引言

5.2 材料设备与方法

5.2.1 主要试剂与材料

5.2.2 主要仪器

5.2.3 实验菌株

5.2.4 培养基

5.2.5 抗生素溶液

5.2.6 药敏试验

5.2.7 抗生素敏感性标准

5.2.8 抗生素最低敏感浓度的测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 35株菌株抗生素敏感性试验

5.3.2 35株菌MIC的测定

5.4 本章小结

参考文献

第六章蛭弧菌的分离纯化及对病原菌的裂解

6.1 引言

6.2 材料设备与方法

6.2.1 主要试剂与材料

6.2.2 主要仪器

6.2.3 培养基

6.2.4 样品的采集

6.2.5 蛭弧菌的分离纯化

6.2.6 蛭弧菌电镜观测

6.2.7 蛭弧菌特异性 PCR

6.2.8 蛭弧菌对不同盐度适应性的测定

6.2.9 蛭弧菌对不同温度适应性的测定

6.2.10 蛭弧菌对宿主的依赖性

6.2.11 蛭弧菌对35株菌的裂解谱

6.3 结果和讨论

6.3.1 电镜观测结果

6.3.2 蛭弧菌特异性PCR扩增反应

6.3.3 盐度对蛭弧菌生长的影响

6.3.4 温度对蛭弧菌生长的影响

6.3.5 蛭弧菌对宿主菌状态的依赖性

6.3.6 株蛭弧菌对33株宿主菌的裂解谱

6.4 本章小结

参考文献

结论与展望

在读期间发表与学位论文内容相关的学术论文

致谢

附录1 菌株胞外产物分析结果

附录2 回归感染实验数据图

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