抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白（雷普克）的药学研究及抗肿瘤机理探索

论文题目: 抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白（雷普克）的药学研究及抗肿瘤机理探索

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 葛保胜

导师: 秦松

关键词: 重组别藻蓝蛋白雷普克,工艺放大,质量控制,免疫促进,羟自由基清除,抗肿瘤

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 基因重组别藻蓝蛋白(雷普克)为本实验室利用基因工程技术构建的海洋活性蛋白。经过前期的开发证明,雷普克为一高效低毒的抑瘤因子,具有较大的开发潜力。本研究对雷普克的药学资料进行了研究,并初步探讨了其作用机制。1.根据基因工程药物研发要求,利用卡那抗性基因替换了原生产菌株的氨苄青霉素抗性基因,并采用平板划线法将雷普克生产菌株传代至100代,其生长速度、抗生素抗性、限制性内切酶酶切图谱、雷普克表达水平等均无明显差异,显示出较好的遗传稳定性。经测定三批雷普克的N端15个氨基酸序列均一致。2.在原来小试发酵和纯化生产工艺的基础上,进行了放大生产,并进一步优化补料速率和纯化工艺。放大后的生产工艺基本稳定,雷普克表达量占菌体可溶性蛋白的41.3%,OD600达到78,纯化后雷普克纯度达到98%以上,生产规模达到克级水平。进一步的药效学试验表明,雷普克对人肝癌SMMC-7721裸鼠模型具有显著的抑制作用。3.采用SRB法建立了雷普克体外活性检测方法,利用HPLC等技术对雷普克的肽指纹图谱进行了分析,保证了样品批次之间的一致性,并对雷普克中的内毒素、残余宿主蛋白等微量杂质进行了测定,进一步完善了雷普克质量检定体系。4.抗肿瘤机理探索:初步的药理试验结果表明,雷普克无明显的体外细胞毒作用; 经体内给药可以促进T细胞的增殖,促进细胞因子IL-2和γ-IFN产生。采用脱氧核糖法测定显示,雷普克具有较强的羟自由基清除能力。提示免疫促进和羟自由基清除能力有可能是雷普克抗肿瘤作用机制之一。5.抗肿瘤活性验证:分别构建表达了6种重组别藻蓝蛋白亚基组分,进行了体内活性筛选。结果显示,His-βAPC对S180实体瘤、小鼠H22肝癌和人肝癌细胞株SMMC-7721裸鼠模型均显示出了较好的抑瘤效果,有望开发为新一代抗肝癌创新药物。本研究完善了雷普克药学资料,并初步探讨了其作用机理,为其作为抗肿瘤一类新药的开发进一步奠定了基础。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 引言

第一节 藻胆蛋白研究进展

1 藻胆蛋白的结构与特性

2 藻胆蛋白分子的起源及进化

3 藻胆蛋白的基因工程

4 藻胆蛋白的功能及应用开发

4.1 藻胆蛋白的生物学功能

4.2 藻胆蛋白的应用

第二节 生物制药研发中的工艺放大

1 发酵工艺放大过程中的影响因素

2 常见的发酵工艺放大方法

3 纯化工艺的放大

第三节 基因工程药物的质量控制

1 基因工程药物的质量要求

2 重组DNA 药物质量控制要点

3 蛋白质性质的鉴定

4 安全性评价

第四节 本论文工作研究的目标、意义及总体思路

第二章 雷普克生产菌株的改造及遗传稳定性研究

第一节 雷普克生产菌株的抗性基因改造

1 材料和方法

2 结果

2.1 卡那霉素抗性基因序列分析

2.2 卡那抗性质粒的构建及酶切鉴定

2.3 抗性基因替换前后菌株生长曲线

2.4 抗性基因替换前后质粒稳定性的变化

2.5 抗性基因替换前后雷普克表达量比较

2.6 Westen blot 分析

3 讨论

第二节 雷普克生产菌株遗传稳定性的研究

1 材料与方法

2 结果

2.1 菌落形态与生长

2.2 质粒稳定性检查

2.3 质粒酶切鉴定

2.4 SDS-PAGE 电泳鉴定

2.5 雷普克的Western blot 鉴定

3 讨论

4 本章小结

第三章 雷普克发酵及纯化工艺的放大

1 材料与方法

2 结果

2.1 雷普克5L 发酵中,不同的补料方式对发酵过程的影响

2.2 20m L 小柱的纯化工艺

2.3 雷普克的30L 中试发酵

2.4 雷普克30L 发酵中重组质粒的稳定性

2.5 雷普克纯化工艺的放大

3 讨论

4 本章小结

第四章 雷普克质量检定标准的建立

第一节 种子库的建立、检定、保存

1 种子库的建立与检定

2 生产种子库的检定

2.1 划种LB 琼脂平板

2.2 涂片革兰氏染色

2.3 对抗生素的抗性

2.4 电镜检查

2.5 生化反应

2.6 雷普克的表达量

2.7 质粒检查

2.8 表达的雷普克抗原性鉴定

3 讨论

第二节 雷普克终产品质量控制体系的建立

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 活性检测

2.2 雷普克纯度鉴定

2.3 雷普克的分子量测定

2.4 雷普克的抗原性鉴定(Western blot)

2.5 外源性DNA 残留量的测定

2.6 宿主菌蛋白残留量的测定

2.7 细菌内毒素检查

2.8 等电点

2.9 紫外光谱扫描

2.10 肽图分析

2.11 N-末端氨基酸序列测定

3 讨论

4 本章小结

第五章 雷普克生物活性的进一步研究

第一节 雷普克抗肿瘤机制的探索

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 雷普克的体外抗肿瘤试验

2.2 雷普克对人肝癌裸小鼠移植瘤SMMC-7721 的实验治疗作用

2.3 雷普克的抗肿瘤机制研究

2.4 雷普克对羟自由基清除能力研究

第二节 雷普克系列组份抗肿瘤活性的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 雷普克系列组份的表达及纯化

2.2 APC 的纯化提取

2.3 雷普克系列组分的体内药效学筛选

2.4 Hβ对小鼠肝癌H22 的实验治疗作用

2.5 Mβ、Hβ对人肝癌SMMC-7721 裸小鼠移植瘤的实验治疗作用

3 讨论

4 本章小结

结论

参考文献

仪器

发表论文

致谢

发布时间: 2006-04-28

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