论文摘要
金属蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12同属于ADAMTS家族（含TSP结构的去整合素金属蛋白酶,a disintegrin and metalloprotease with thromospondinmotifs,ADAMTS）,其对降解软骨细胞外基质蛋白和关节炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性锌指蛋白,并且有较严谨的分子结构,至少包括一个thrombospondin motif重复结构。这个家族具有重要的功能,ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-16和ADAMTS-18可以降解多聚蛋白糖,ADAMTS-5在小鼠关节炎模型中蛋白多聚糖的丢失上起着重要的作用。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的结构域组成,构成ADAMTS家族的亚型。我们最初报道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接结合并降解软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）,一种软骨最主要的非胶原组成物。另外,我们研究发现α-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近还有研究发现ADAMTS-12也能够降解软骨聚集蛋白多糖。本文的研究发现,在软骨分化过程中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达量都显著增高,意味着在骨骼发育中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达量在时间、空间上都有变化。我们的研究重点关注ADAMTS-7和ADAMTS-12在软骨分化中的作用,以及涉及到的分子机制。我们研究发现ADAMTS-7和ADAMTS-12蛋白在软骨分化中被诱导表达。实时荧光定量PCR结果揭示在体外软骨分化的第5天,这两种蛋白的表达量还较低,但从第7天开始,他们的量成三倍增长,并在分化后期一直维持此高表达状态。本文中,我们首次发现ADAMTS-7和ADAMTS-12都能够抑制软骨细胞的分化及软骨成骨。我们研究发现ADAMTS-7对软骨细胞的分化及软骨成骨的抑制功能是依赖于ADAMTS-7的蛋白酶活性的。ADAMTS-7的cysteine-rich结构域对于ADAMTS-7与细胞外基质相互作用和细胞膜表面定位是必不可少的,C-末端的4个thromospondin motif结构域对于ADAMTS-7的蛋白水解酶活性和抑制软骨细胞分化功能也是必需的。因此,ADAMTS-7对于软骨细胞分化和软骨成骨,是一个潜在的负调控因子,这种抑制功能严格地依赖于ADAMTS-7的酶切活性。而当ADAMTS-7发生点突变后,则完全丧失了酶切活性,同时也丧失了对软骨细胞的抑制作用。ADAMTS-7由多个功能性亚基构成,包括一个锌离子催化结构域和其他几个非催化结构域,包括:1个disintegrin结构域、1个thrombospondin结构域、1个cysteine-rich结构域（CRD）、1个spacer-1结构域、3个thrombospondin motifs、1个spacer-2结构域和C-末端4个thrombospondin motifs。研究发现C-末端的4个thrombospondin motifs具有结合底物的功能,如结合COMP,而ADAMTS-7的其他功能结构域的生物学功能却还都不清楚。为了揭示各个结构域的功能,我们构建了一系列的ADAMTS-7的C-末端缺失突变体,发现ADAMTS-7的cysteine-rich结构域对于ADAMTS-7与软骨细胞外基质相互作用和细胞膜表面定位是必不可少的。然而有趣的是,ADAMTS-7及一系列C-末端缺失突变体蛋白在Cos-7细胞中的检测结果显示,cysteine-rich结构域对ADAMTS-7蛋白定位的影响,是有细胞类型特异性的。另外,ADAMTS-7的酶切活性同样也受到非催化亚基的调控,尤其是C-末端的4个thrombospondinmotifs和抑制性spacer-2结构域。ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP重要的靶分子,原因如下:（1）PTHrP诱导ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达,（2）在PTHrP基因敲除小鼠的软骨生长板上几乎检测不到ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达,（3）沉默ADAMTS-7/ADAMTS-12或用特异性抗体封闭ADAMTS-7/ADAMTS-12的活性,则几乎阻断了PTHrP介导的抑制软骨细胞肥大化和软骨成骨的生长。研究发现ADAMTS-7和一个新的软骨生长因子GEP（Granulin-epithelin precursor）相互作用。骨骺生长板内的软骨内骨化过程,涉及多个信号传导途径。我们的研究证明:1)过表达ADAMTS-7和ADAMTS-12诱导PTHrP,抑制IHH;2)在体外软骨分化过程中,PTHrP促进ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达:3)在小鼠生长板软骨细胞中,ADAMTS-7和ADAMTS-12的表达依赖于PTHrP信号途径。这些研究结果揭示在软骨分化过程中,ADAMTS-7、ADAMTS-12和PTHrP信号途径之间存在一个正反馈通路。另外,ADAMTS-7、ADAMTS-12是PTHrP的下游靶分子,基于以下原因:1)PTHrP抑制软骨分化过程中Col X的表达,然而当通过特异性干扰RNA抑制ADAMTS-7/ADAMTS-12或用抗ADAMTS-7/ADAMTS-12的抗体封闭后,PTHrP的抑制作用则消失了;再次表达ADAMTS-7/ADAMTS-12,则PTHrP的抑制作用又重新回复:2)ADAMTS-7/ADAMTS-12抗体的封闭,则完全中和了PTHrP所抑制的软骨细胞肥大化、矿化和骨生长。另外,研究发现PTHrP促进软骨细胞的增殖,ADAMTS-7发现也具有促进软骨细胞增殖的功能,而且此促细胞增殖作用主要依赖于C-末端的4个thrombospondin motifs结构域。另外ADAMTS-7可以作为GEP-转化酶,抵消GEP刺激诱导的软骨分化及软骨内成骨。总之,我们的试验结果证明,ADAMTS-7是PTHrP信号途径下游的非常重要的靶分子,负调控软骨内成骨过程;直接结合、转化GEP,从而失活软骨分化生长因子GEP的诱导分化作用。GEP是一种生长因子,参与组织重生、肿瘤形成和炎症过程。研究发现GEP与弹性蛋白酶结合,被弹性蛋白酶降解。弹性蛋白酶消化GEP的颗粒内连接子,产生微粒多肽;然而分泌性白细胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI）直接结合到弹性蛋白酶或抑制颗粒多肽与蛋白酶的结合,继而封闭弹性蛋白酶的活性。最近研究揭示蛋白酶3也结合并降解GEP;蛋白酶3和弹性蛋白酶都通过降解抗炎症作用的GEP,从而达到促进嗜中性粒细胞依赖性的致炎症功能。本文中,我们提供了足够的试验证据表明GEP和金属蛋白酶ADAMTS-7在软骨细胞内相互作用,ADAMTS-7可以将GEP转化为小分子片段;另外,GEP能具有促进软骨细胞分化和软骨成骨,而ADAMTS-7很可能是通过失活GEP的活性而抑制软骨分化及软骨成骨的。我们以往研究发现:1)ADAMTS-7结合并降解COMP,2)COMP和GEP相互作用,促进GEP刺激的软骨分化功能。结合现在我们的结果ADAMTS-7和GEP相互作用,我们发现ADAMTS-7、GEP和COMP形成一个调节软骨细胞功能的蛋白质-蛋白质相互作用网。然而ADAMTS-7、生长因子GEP和细胞外基质COMP之间是如何相互作用,如何调控软骨细胞分化和软骨成骨的。本文研究发现ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP调控通路中的新调控因子,同时也可调控软骨细胞分化和软骨内成骨。本文对ADAMTS-7、ADAMTS-12负调节软骨分化的机制进行了初步探讨,例如金属蛋白酶ADAMTS-7和促软骨分化作用的生长因子GEP相结合,通过转化GEP成片段从而抑制GEP刺激的软骨分化作用。另外,本文也为软骨关节炎疾病提供了潜在的靶分子。
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