基于表面分子印迹技术的抗幽门螺杆菌生物粘附给药系统的初步研究

论文摘要

消化道溃疡是一类世界性疾病,发病率高,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）感染是引起慢性胃炎、消化性溃疡等胃肠道疾病的重要原因之一。然而,H. pylori感染的根治目前仍是一个世界性难题。研究发现,造成H. pylori根治失败的主要原因是：H. pylori分布在粘液下的胃上皮细胞间隙,其上覆盖了具有强粘弹性的、厚度为50-450μm的粘液层,药物及其制剂较难穿透该粘液层到达病菌所在部位。即便是能够穿透粘液层的药物,也因其无法锚定在细菌表面,而会随粘液的不断更新而流失,因此难以在H. pylori周围长时间维持有效药物浓度,达到杀菌的目的。对H. pylori的研究表明,Lpp20是保守的H. pylori外膜相关脂蛋白,分子量约为20,000,在所有的菌株上均有表达,其上存在一段暴露的抗原片段（N末端83-115氨基酸序列,简称NQA）,它是开发H. pylori疫苗和治疗药物的潜在靶点。分子印迹材料以其特异性强、稳定性好、可反复使用等特点得到了广泛关注和深入研究,尤其是以蛋白质多肽类为模板分子的印迹材料更是具有代替天然抗体而成为一类新型生物材料的潜能。本课题旨在构建一种基于表面分子印迹技术的抗H. pylori生物粘附纳米给药系统。选择表达于H. pylori表面的抗原片段NQA为目标分子,利用分子印迹技术在纳米粒表面构建NQA的特异性结合位点。当分子印迹纳米粒到达H. pylori所在部位时,纳米粒表面的“印迹”可帮助其与H pylori表面的抗原活性多肽片段发生“嵌合”,从而使纳米粒“锚定”于病菌表面,延长药物在病菌周围的滞留时间,并达到维持局部药物水平的效果。这种表面分子印迹纳米粒既可以保留类似“抗原-抗体”的特异性结合作用,又避免了抗体修饰的给药系统易产生的免疫原性和抗体失活的问题,是一种可以达细菌水平的新型生物粘附纳米给药系统。鉴于上述课题设计理念,本论文分为两部分：第一部分：模型蛋白表面分子印迹微球的研究这部分研究以溶菌酶作为模型蛋白制备分子印迹聚合物微球,是出于以下考虑：溶菌酶价廉易得,分子量适宜,性质稳定,具一定的两亲性,倾向于停留在油-水两相界面上,用其作为模板制备的分子印迹微球在一定程度上具有表面印迹的特点,对我们进一步研究基于表面分子印迹技术的纳米载药系统具有一定的启迪作用,并能在方法学上奠定良好的基础。以丙烯酰胺为功能单体、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,溶菌酶为模板蛋白,用反相悬浮聚合法制备溶菌酶分子印迹微球。以光学显微镜和扫描电镜观察微球的外观形态,并分别测定了平均粒径和zeta电位。在水和生理盐水两种介质中研究溶菌酶印迹微球的吸附动力学性质,测定印迹微球对溶菌酶的吸附量、选择性和竞争环境下的特异性吸附能力。结果表明,溶菌酶分子印迹微球外观圆整,平均粒径在35μm左右,zeta电位约-30mV。微球对溶菌酶的吸附过程在40min内达到平衡。无论在单一蛋白质还是有其它蛋白质干扰的竞争环境中,印迹微球对模板蛋白溶菌酶都表现出特异性识别能力。在生理盐水介质中,由于降低了非特异性吸附,印迹效果尤为显著。第二部分：基于表面分子印迹技术的抗幽门螺杆菌生物粘附纳米粒的研究这部分研究以丙烯酰胺为功能单体、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,用反相微乳液聚合法制备H. pylori表面抗原片段NQA的分子印迹纳米粒。为达“表面印迹”的目的,在亲水性多肽NQA上修饰一段脂肪酸长链使其改性成为两亲性分子,从而在聚合时尽可能停留在纳米粒的表面。除传统的宏观重结合实验外,引入表面等离子共振法、荧光偏振技术和‘’zeta电位差异法”评价模板多肽与表面印迹纳米粒间的相互作用。各种方法得出的结果皆表明,表面印迹纳米粒对其模板分子有更强的亲和力。纳米粒与H. pylori的体外初步粘附实验表明,此种纳米粒能通过识别H. pylori上的靶位点,成功实现对整个细菌的特异性粘附。总之,我们从模型蛋白分子印迹微球的研究中得到启发,首次将分子印迹技术引入抗幽门螺杆菌生物粘附纳米给药系统中,进行了一系列初步研究。本文着重探讨了“表面印迹”策略,并对各种印迹效果的评价方式进行了有益的探索,己取得比较实质性的成果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 模型蛋白表面分子印迹微球的研究
• 第一节 溶菌酶分子印迹微球处方和工艺的研究
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 分子印迹微球及非印迹微球的制备方法
• 2.2 模板蛋白脱除方式的考察
• 2.2.1 异硫氰酸荧光素标记Lyz
• 2.2.2 模板蛋白的脱除
• 3 结果与讨论
• 3.1 反相悬浮聚合法制备分子印迹微球
• 3.2 模板蛋白脱除方式的考察
• 第二节 溶菌酶分子印迹微球理化性质的表征
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 微球外观形态的观察
• 2.2 微球平均粒径及zeta电位的测定
• 2.3 微球在水中溶胀情况的考察
• 3 结果与讨论
• 3.1 微球外观形态的表征
• 3.2 微球的平均粒径和zeta电位
• 3.3 微球在水中的溶胀情况
• 第三节 蛋白质浓度测定方法的建立
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 用BCA试剂盒测定Lyz、RNase A和BSA的浓度
• 2.2 HPLC测定Lyz和RNase A混合蛋白质溶液中单一蛋白质的浓度
• 2.2.1 色谱条件
• 2.2.2 标准曲线的制备
• 2.2.3 回收率和精密度
• 3 结果与讨论
• 3.1 BCA试剂盒法制备Lyz、RNase A和BSA的标准曲线
• 3.2 HPLC测定Lyz和RNase A混合蛋白质溶液中单一蛋白质的浓度
• 3.2.1 HPLC对Lyz和RNase A的分离效果
• 3.2.2 HPLC法制备Lyz和RNase A的标准曲线
• 3.2.3 回收率和精密度
• 第四节 溶菌酶分子印迹微球印迹效果的评价
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 Lyz-MIP和NIP与模板蛋白Lyz的吸附动力学曲线
• 2.2 微球与模板蛋白的重结合
• 2.3 微球与三种蛋白质的选择性结合
• 2.4 两种蛋白质（Lyz和RNase A）对微球的竞争结合
• 2.5 统计学方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 吸附动力学曲线
• 3.2 微球与模板蛋白的重结合
• 3.3 微球与蛋白质的选择性结合
• 3.4 两种蛋白质的竞争结合
• 本章小结
• 参考文献
• 第二章 基于表面分子印迹技术的抗幽门螺杆菌生物粘附纳米粒的研究
• 第一节 表面分子印迹纳米粒的制备与表征
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 反相微乳液聚合法制备表面分子印迹纳米粒
• 2.2 纳米粒平均粒径和粒径分布的测定
• 2.3 纳米粒外观形态的考察
• 3 结果与讨论
• 3.1 表面分子印迹纳米粒的制备策略
• 3.2 纳米粒的平均粒径和粒径分布
• 3.3 纳米粒的外观形态
• 第二节 印迹效果评价方式的探索
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 宏观重结合实验
• 2.2 表面等离子共振法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 2.3 zeta电位差异法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 2.4 荧光偏振法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 2.5 统计学方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 宏观重结合实验
• 3.2 表面等离子共振法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 3.3 zeta电位差异法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 3.4 荧光偏振法测定纳米粒与模板NQA的相互作用
• 第三节 纳米粒与幽门螺杆菌体外粘附效果的初步评价
• 1 材料和仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 载荧光素FAM的纳米粒的制备
• 2.2 纳米粒与H.pylori的体外粘附实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 纳米粒与H.pylori的体外粘附效果
• 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 发表或者拟发表的论文
• 致谢