新型酿酒酵母整合载体的构建及构建方法研究

论文摘要

本研究主要探讨一种酵母菌染色体定点整合载体的构建方法及其实现染色体定点整合的可行性。参照SGD数据库提供的酵母菌全基因组序列信息,选取4号染色体上基因HEM13上游-750--2150bp处无基因活性的DNA序列作为基因定点整合的靶位点。在这1400bp的DNA序列中选取毫不重合的两部分,大小分别为744bp和602bp,作为整合载体的两个同源臂hom1和hom2。载体pUC18-INT4是本研究需要构建的目的载体,它的构建基础是本实验室已经构建的载体pUC18-RYUR。pUC18- INT4载体的构建是将两段同源臂hom1和hom2按照其在染色体上的位置和方向分别取代pUC18-RYUR上的两段repeat序列。由此,构建成了pUC18-INT4载体。本试验使用酵母菌乙醇脱氢酶1（ADH1）基因作为验证pUC18-INT4载体实现基因定点整合的验证基因。用PCR方法扩增得到ADH1基因序列,利用限制性内切酶位点,使其连接在pUC18-INT4载体上,取代URA3序列,构建成pUC18-INT4-A载体。pUC18-INT4载体实现基因定点整合需要两个步骤,第一步:将pUC18-INT4载体转化URA3序列缺失的酵母菌株,涂布于省却尿嘧啶的培养基平板,利用选择标记基因URA3和PCR方法筛选出URA3序列正确整合的酵母菌株;第二步:将pUC18-INT4-A载体转化在第一步中实现URA3序列正确整合的酵母菌株,利用URA3基因编码的酶催化5-氟乳清酸（5-foa）产生细胞毒害物的特性和PCR方法筛选出实现ADH1基因正确整合的酵母菌株。由结果可知,用此方法构建的基因整合载体pUC18-INT4能够成功的实现基因在酵母菌中的染色体定点整合。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 基因打靶研究现状
• 1.2 基因打靶的基本原理及分子机制
• 1.2.1 Holliday 模型
• 1.2.2 Meselson-Radding 模型
• 1.2.3 双链断裂修复模型（DSBR）
• 1.3 基因打靶策略
• 1.3.1 利用置换型载体的完全基因敲除
• 1.3.2 利用插入型载体的完全基因敲除
• 1.4 基因打靶的影响因素
• 1.5 基于Cre-LoxP 重组酶系统的条件基因打靶
• 1.5.1 Cre-LoxP 重组酶系统实现基因重组的原理
• 1.5.2 条件基因打靶
• 1.6 基因打靶的应用前景
• 1.6.1 基因打靶应用于基因功能研究
• 1.6.2 基因打靶应用于研究疾病的动物模型
• 1.6.3 基因打靶应用于改良动物品系和研制生物反应器
• 1.7 本课题研究思路
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 药品
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化
• 2.2.3 质粒的提取
• 2.2.4 酵母染色体的快速分离
• 2.2.5 酵母细胞的转化
• 2.2.6 PCR 扩增
• 2.2.7 DNA 的限制酶消化
• 2.2.8 凝胶电泳法检测DNA
• 2.2.9 DNA 样品的回收纯化
• 2.2.10 DNA 连接反应
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 质粒pUC18-INT4 的构建
• 3.1.1 将hom1 片断克隆在T 载体上构建质粒T-hom1
• 3.1.2 将hom2 片断克隆在T 载体上构建质粒T-hom2
• 3.1.3 将 hom1 片断克隆在 pUC18-RYUR 载体上构建质粒 pUC18-hom1
• 3.1.4 将 hom2 片断克隆在 pUC18-hom1 载体上构建质粒 pUC18-INT4
• 3.2 质粒pUC18-INT4-A 的构建
• 3.2.1 将ADH1 克隆在T 载体上构建T-ADH1
• 3.2.2 将 ADH1 克隆在 pUC18-INT4 载体上构建 pUC18-INT4-A 质粒分子
• 3.3 pUC18-INT4 质粒转化酵母细胞
• 3.4 pUC18-INT4-A 质粒转化酵母细胞
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢