耐碳青霉烯肠杆菌科细菌临床株耐药机制的研究

论文摘要

目的碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的一线药物,由于此类抗生素应用的增多,对碳青霉烯耐药的临床株陆续出现。根据中国细菌耐药性监测-CHINET监测,2009年肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的总耐药率已经超过1%,相比2008年有增加的趋势。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制主要包括产碳青霉烯酶和外膜蛋白的缺失伴或不伴高水平的p-内酰胺酶（AmpC酶、ESBLs等）的产生。本实验主要采用分子生物学的方法研究肠杆菌科细菌临床株对碳青霉烯耐药的机制,从而为指导医生合理使用抗菌药物,避免或减少细菌耐药性的出现或传播、新型抗菌药物的开发及新型作用靶位的研制提供依据。方法1、菌株收集与药敏试验：从2009年3月至2010年4月天津市某三甲医院临床分离出肠杆菌科细菌227株,其中多重耐药菌株41株。根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2010年标准,采用微量肉汤稀释法和琼脂纸片扩散法测定临床菌株12种常用抗菌药物（左氧氟沙星、环丙沙星、头孢毗肟、头孢他啶、氧氟沙星、阿米卡星、哌拉西林、头孢氨噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素）的MIC值及3种常用碳青霉烯类抗生素（亚胺培南、美罗培南、厄他培南）的抑菌圈直径,了解肠杆菌科细菌临床株对碳青霉烯耐药的情况。2、碳青霉烯酶检测：通过碳青霉烯酶确证试验-改良Hodge试验和金属酶筛选试验-EDTA协同试验初步判定耐碳青霉烯临床株是否产碳青霉烯酶,通过PCR扩增常见的5种碳青霉烯酶基因,包括KPC酶,金属酶（IMP型、VIM型及NDM-1型）以及OXA-48型碳青霉烯酶,了解碳青霉烯耐药临床株碳青霉烯酶基因携带情况。3、外膜蛋白研究：对耐碳青霉烯菌株及敏感株的外膜蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）,对比外膜蛋白的缺失情况,即阴沟肠杆菌、产气肠杆菌及肺炎克雷伯菌的与耐药有关的外膜蛋白OmpF、OmpE36和OmpK36/35,在SDS-PAGE图谱上分别可见为38KDa、42KDa、39KDa/37KDa大小的条带。PCR扩增编码OmpF、OmpE36和OmpK36/35外膜蛋白的基因,进行DNA和氨基酸序列分析及跨膜片段的预测。4、其他p-内酰胺酶检测：通过PCR检测耐碳青霉烯菌株其他p-内酰胺酶基因的携带情况,包括常见的广谱及超广谱p-内酰胺酶基因（TEM、SHV及CTX-M-1、2、9组ESBLs）和DHA型质粒AmpC酶基因。结果1、药敏试验：从227株肠杆菌临床株中筛选出6株对碳青霉烯耐药的临床株（2株阴沟肠杆菌E2414、E2166,3株产气肠杆菌Ea2880、Ea293、Ea391,1株肺炎克雷伯菌Kp382）,分离率为2.6%,占多重耐药肠杆菌科细菌的14.6%。6株耐药菌对厄他培南、头孢类抗生素以及含酶抑制剂的p-内酰胺酶类耐药率均达到100%,对亚胺培南和美罗培南的耐药率为50%,对氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗生素耐药率分别为83.34%和66.67%。其中有3株（E2414, Ea391, Kp382）为泛耐药菌株（对抗假单胞菌头孢菌素（头孢他啶、头孢吡肟）、抗假单胞菌碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南、厄他培南）、含有p-内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类均耐药）2、碳青霉烯酶检测：6株耐碳青霉烯临床株中有3株改良Hodge试验阳性,包括E2414,Ea391和Kp382,提示可能产碳青霉烯酶。6株耐药菌的EDTA协同试验均为阴性,提示可能不产金属酶。PCR扩增常见的5种碳青霉烯酶基因,包括KPC酶,金属酶（IMP型、VIM型及NDM-1型）以及OXA-48型碳青霉烯酶,均为阴性结果,提示6株耐药菌可能不携带这几种碳青霉烯酶。3株改良Hodge试验阳性而不携带常见的碳青霉烯酶,推测可能因携带其他碳青霉烯酶基因介导耐药（如IMI型酶等）,或有其他耐药机制参与（如外膜蛋白的缺失）。3、外膜蛋白研究：SDS-PAGE外膜蛋白图谱及相关外膜蛋白基因检测表明,2株阴沟肠杆菌（E2414和E2166）缺失与碳青霉烯耐药相关的38KDa大小的条带,PCR扩增相关基因OmpF,证实基因缺失。3株产气肠杆菌中Ea2880和Ea293缺失与碳青霉烯耐药相关的42KDa大小的条带,PCR扩增相关基因OmpE36,Ea293存在OmpE36基因的缺失,Ea2880扩增出OmpE36基因,经序列分析显示Ea2880与GenBank公布的产气肠杆菌标准株ATCC13048的DNA及氨基酸序列差异较大,相似性均为87%,对该蛋白质进行跨膜片段的预测,显示二者均有12个跨膜片段,其中第7个跨膜片段存在差别。另一株产气肠杆菌Ea391在外膜蛋白图谱上无明显变化,但PCR扩增相关的外膜蛋白基因OmpE36,证实基因缺失。1株肺炎克雷伯菌Kp382在外膜蛋白图谱上无明显变化,但PCR扩增相关的外膜蛋白基因OmpK36/35,证实基因缺失。4、其他β-内酰胺酶检测：对6株耐碳青霉烯临床株PCR扩增常见的广谱及超广谱β-内酰胺酶基因（TEM、SHV及CTX-M-1、2、9组ESBLs）和DHA型质粒AmpC酶基因。阴沟肠杆菌E2414携带TEM-1型广谱酶及CTX-M-9组ESBLs;产气肠杆菌Ea2880携带SHV-11型及CTX-M-9组ESBLs, Ea391携带TEM-1型广谱酶；肺炎克雷伯菌Kp382和阴沟肠杆菌E2166均为阴性。结论1、在天津某医院从227株肠杆菌科细菌临床株中已分离到6株耐碳青霉烯的菌株,分离率为2.6%,其中3株为泛耐药菌株。2、6株耐碳青霉烯临床株中尚未检测到常见的碳青霉烯酶基因,但E2414携带CTX-M-9组ESBLs, Ea2880携带SHV-11型及CTX-M-9组ESBLs。3、外膜蛋白图谱及相关外膜蛋白基因检测表明,6株耐碳青霉烯临床株均存在外膜蛋白的缺失或外膜蛋白基因的缺失或突变。4、总之,从天津某医院分离的6株耐碳青霉烯临床株对碳青霉烯耐药的主要原因可能不是产常见的碳青霉烯酶。外膜蛋白的缺失或外膜蛋白基因的缺失或突变介导的耐药,以及产超广谱β-内酰胺酶等其他机制起了重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 技术路线图
• 一、耐碳青霉烯肠杆菌科细菌临床株的耐药谱分析
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 对象
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 药物敏感试验
• 1.2.2 耐药谱分析
• 1.3 讨论
• 二、耐碳青霉烯肠杆菌科细菌临床株碳青霉烯酶的检测
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 对象
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 改良Hodge试验（产碳青霉烯酶确证试验）
• 2.2.2 EDTA协同试验（金属酶筛选试验）
• 2.2.3 碳青霉烯酶基因PCR扩增结果
• 2.3 讨论
• 三、耐碳青霉烯肠杆菌科细菌临床株外膜蛋白的研究
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 对象
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 10%SDS-PAGE
• 3.2.2 PCR扩增外膜蛋白基因
• 3.2.3 PCR扩增β-内酰胺酶基因
• 3.3 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制
• 综述参考文献
• 致谢