慢病毒介导靶向沉默诱骗受体3（DcR3）在胰腺癌中诱导凋亡的实验研究

论文摘要

第一部分DcR3在胰腺癌中的扩增、表达及临床意义目的研究胰腺癌中DcR3的基因扩增、表达与临床病理因素、预后生存的相关性。方法分别应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学法（IHC）和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）检测50例胰腺癌组织中DcR3基因扩增和表达情况以及凋亡细胞的分布，分析其相关性及与临床病理因素之间的关系。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胰腺癌患者血清中DcR3的表达，分析其与预后生存的相关性。结果胰腺癌组织中DcR3的基因扩增超过2倍的有21例（占42%），而非癌胰腺组织中未见扩增倍数阳性病例（P＜0.01）。胰腺癌组织中DcR3mRNA表达明显高于非癌胰腺组织（P＜0.01），胰腺癌组织中21例DcR3基因扩增组，其DcR3mRNA为0.82±0.59，DcR3基因无扩增组29例，其mRNA为0.34±0.11，两组差异有统计学意义（P＜0.05），同时发现两组的DcR3蛋白阳性率分别为71.4%和34.5%，两组差异有统计学意义（P＜0.01），说明DcR3的过表达依赖于基因扩增。IHC结果显示DcR3蛋白在细胞内主要分布于胞浆中，在胰腺癌中的阳性表达率高于非癌胰腺组织（P＜0.01），并且与凋亡细胞数呈负相关。在临床病理因素分析中，DcR3的阳性表达与肿瘤大小、TNM分期有关。胰腺癌患者术前血清中DcR3的表达量高于胰腺良性肿瘤（P＜0.01），且肿瘤切除后DcR3水平明显下降（P＜0.01）。50例患者术后随访，中位生存时间为18.5月，DcR3在血清中的表达与患者的生存时间有关（P＜0.01），Cox分析显示胰腺癌患者总体生存时间相关指标有肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和DcR3表达水平。结论胰腺癌组织中存在DcR3基因扩增和过表达，基因扩增是其过表达的因素之一。DcR3的表达与肿瘤细胞的凋亡、临床病理因素（肿瘤大小、TNM分期）相关。胰腺癌患者血清中DcR3高表达，并与患者预后相关，可作为判断患者预后的指标之一。第二部分靶向人DcR3的miRNA干扰质粒的构建和功能筛选目的设计并构建靶向人DcR3基因的miRNA干扰质粒，并筛选出基因沉默效果最佳的干扰质粒。方法根据GenBank中DcR3的基因序列（NM003823），设计四条靶向人DcR3的miRNA序列，分别退火后连接到PP-GFP-miR载体上，经酶切鉴定及测序后与DcR3过表达载体共转染293T细胞，Western Blot筛选出最佳序列。结果经双酶切鉴定及测序，靶向DcR3基因的重组miRNA干扰质粒构建成功，并能有效抑制DcR3的表达，且DcR3-miRNA-4效果最佳。结论靶向DcR3的miRNA干扰质粒表达载体构建成功，可作为进一步研究该基因功能的工具。第三部分DcR3-miRNA的慢病毒包装及验证目的构建靶向DcR3的慢病毒干扰载体，转染胰腺癌Panc-1细胞进行验证。方法携带DcR3-miRNA的慢病毒质粒与包装质粒、包膜质粒共转染293T细胞进行病毒包装并测定滴度。重组病毒感染Panc-1细胞后流式细胞术检测转染率，RT-PCR和Western blot鉴定DcR3基因的沉默效果及干扰素效应。结果靶向DcR3的慢病毒干扰载体成功包装出病毒，病毒滴度为7×109TU/ml。重组慢病毒载体成功转染Panc-1细胞，转染率大于90%，RT-PCR和Western blot检测证实重组慢病毒能有效抑制DcR3的表达（P＜0.05；P＜0.05），且无干扰素效应（P＞0.05）。结论成功制备LV-DcR3-miRNA病毒载体并转染胰腺癌Panc-1细胞，有效抑制DcR3的表达。第四部分靶向沉默DcR3对人胰腺癌细胞增殖与凋亡影响的体外研究目的研究慢病毒介导靶向沉默DcR3后对人胰腺癌Panc-1细胞生长、增殖与凋亡的影响和可能机制。方法实验细胞分为三组：LV-RNAi（细胞感染慢病毒干扰载体），LV-NC（细胞感染空病毒）和Control（未感染的细胞）。CCK8法（Cell Count Kit）检测细胞生长，克隆形成实验及EdU法（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。对沉默DcR3的Panc-1细胞（LV-RNAi）和阴性对照组（LV-NC）进行基因芯片分析及RT-PCR、Western blot验证。结果在FasL单独作用或单独沉默DcR3的情况下，细胞生长、细胞周期和凋亡与阴性对照组相比无明显变化（P＞0.05）。在FasL共培养下，CCK8检测发现LV-RNAi与LV-NC相比细胞生长受到抑制（P＜0.05），细胞克隆形成实验发现LV-RNAi的细胞克隆数少于LV-NC（P＜0.05），相对细胞克隆数减少36.3%，EdU实验发现Control组、LV-NC组和LV-RNAi组的细胞增殖阳性率分别为（69.8±5.93）%、（67.6±5.55）%和（39.2±3.83）%，LV-RNAi组的细胞增殖阳性率分别与另两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组细胞与sFasL（25ng/ml）共培养24h后，流式细胞术检测发现LV-RNAi细胞在G0/G1期分布比例明显增大（P＜0.05vs.LV-NC），S期无明显变化，处于G2/M期的细胞减少（P＜0.05vs.LV-NC），三组细胞凋亡率分别为5.7±0.86%、4.6±0.73%和12.8±1.62%，LV-RNAi与其他两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在mFasL的作用下，LV-RNAi的细胞在G0/G1期分布比例增大，G2/M期减少，分别与control组（+mFasL）和LV-NC组（+mFasL）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪检测细胞早期凋亡发现：Control、LV-NC和LV-RNAi在mFasL的作用下凋亡率分别为3.2±0.35%、2.8±0.26%和11.1±1.49%，LV-RNAi组与其他两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。25ng/ml的sFasL处理LV-RNAi和LV-NC24h后，通过表达谱基因芯片检测和Gene Ontology分析发现LV-RNAi整体上起到了调控凋亡信号传导通路，诱导凋亡和调控G1→S期的关卡，使细胞周期停滞在G0/G1期的作用。RT-PCR发现FADD、Caspase3和Caspase8在LV-RNAi组的表达均明显增强，与Control组和LV-NC组相比差异有统计学意义（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01），且差异倍数和芯片检测基本一致。Western blot检测发现发现单纯沉默DcR3，pERK的相对表达量（pERK/ERK）并无统计学差异（P＞0.05），而在sFasL的作用下，抑制DcR3的表达可减少pERK的表达（P＜0.05,LV-RNAi vs. LV-NC）。结论胰腺癌Panc-1细胞对FasL/Fas介导的凋亡不敏感。靶向沉默DcR3基因可以有效恢复FasL/Fas的作用，抑制细胞恶性增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，FADD、Caspase3、Caspase8和pERK参与DcR3沉默后FasL介导的凋亡过程。第五部分靶向沉默DcR3对胰腺癌移植瘤抑制作用的体内实验目的在动物体内观察靶向沉默DcR3的基因治疗对胰腺癌的作用。方法分别建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤模型，分组干预治疗，IHC验证基因沉默效果。在皮下移植瘤模型中，观察瘤块生长情况，TUNEL和电镜检测凋亡。在原位移植瘤模型中，观察肿瘤浸润转移情况，并进行生存分析。结果IHC检测发现基因沉默治疗后DcR3蛋白表达明显减少（P＜0.05）。基因治疗沉默DcR3后，裸鼠皮下瘤的体积和质量均小于LV-NC组（P＜0.05；P＜0.05）。TUNEL检测发现LV-RNAi组肿瘤中凋亡细胞增多（P＜0.05）。透射电镜下观察到Control组和LV-NC组肿瘤细胞饱满，常染色质存在，异染色质呈颗粒状，核仁呈网状表明核增殖功能旺盛。LV-RNAi组肿瘤细胞出现凋亡细胞特征：细胞体积变小，细胞间连接消失，细胞核内异染色质增多并边集，凝聚在核膜下。原位移植瘤裸鼠在基因治疗后浸润和转移情况有所好转，生存分析发现LV-RNAi组裸鼠荷瘤生存时间较LV-NC延长（P＜0.05）。结论靶向沉默DcR3基因后可以通过沉默移植瘤内DcR3的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，延长裸鼠荷瘤生存时间。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 参考文献
• 第一部分 DCR3 在胰腺癌中的扩增、表达及临床意义
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 靶向人 DCR3 的 MIRNA 干扰质粒的构建与功能筛选
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 DCR3-MIRNA 的慢病毒包装及验证
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 慢病毒介导的DCR3-MIRNA对人胰腺癌细胞生物学行为影响的体外研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第五部分 慢病毒介导的 DCR3-MIRNA 对胰腺癌移植瘤抑制作用的体内研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 全文缩略词
• 攻读学位期间公开发表的论文
• 基金资助及获奖情况
• 致谢