论文摘要
背景药物制成微球后因其对特定器官和组织的靶向性及微粒中药物释放的缓释性,已经成为近年来缓控释剂研究的热点。卡铂是第二代铂类广谱抗癌药,将药物制成微球后顺应了抗肿瘤制剂长效、高效、低毒的发展方向,课题组在前期实验中对卡铂缓释微球优化制备工艺及其对移植性肝肿瘤和胰腺肿瘤的治疗效果、适宜剂量已作初步研究获得了较好的结果。微球体外释放研究能够较好反映微球在体内的释药状况,适宜的体外释放度实验对制剂的安全性与有效性是非常重要的。目前体外释放度测定一般是模仿制剂在体内的运转状况进行的。通常在温度、搅拌、介质、PH值和酶等方面加以模拟。本研究将探讨卡铂缓释微球体外释放机制从而了解药物体内释放的相关性。细胞凋亡是基因或其他一些因素调控的活组织细胞自我消亡的过程,这一过程的紊乱直接影响肿瘤的发生与发展。细胞凋亡调控基因可分别抑制和促进细胞凋亡,其中Bcl-2是凋亡的抑制基因,可以阻断细胞凋亡,Bax可与Bcl-2蛋白形成异源二聚体,具有抑制Bcl-2功能,促进细胞凋亡的作用。卡铂微球瘤内注射治疗大鼠皮下移植瘤微球能否起到诱导细胞凋亡的作用?微球比原药疗效好,会不会是其诱导肿瘤细胞凋亡的能力较原药强呢?目的通过扫描电镜观察卡铂微球体外释放的超微结构变化了解其药物控制释药机理,从而更好的反映微球在体内的释药状况。从细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2?Bax来探讨卡铂微球是否具有诱导大鼠皮下移植瘤细胞凋亡的作用机制,幷进一步证明卡铂微球优于卡铂原药,从而为化疗药缓释微球瘤内注射治疗肿瘤应用于临床奠定基础。方法1.卡铂-PLGA缓释微球体外降解机制探讨通过扫描电镜观察微球体外释放不同时间点（3、7、14、21d）超微结构变化了解其药物控制释药机理。2.大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立采用Walker-256肿瘤细胞株体外培养传代,腹水接种法建立大鼠皮下移植瘤模型;超声动态观测肿瘤大小、二维声像图和彩色多普勒变化,计算肿瘤体积,描绘肿瘤自然生长曲线。3.超声引导瘤内注射卡铂微球治疗大鼠皮下移植瘤的疗效观察将荷瘤大鼠分为微球组、卡铂组、盐水组和空白对照组,以相应药物剂量进行超声引导瘤内注射治疗。超声动态监测肿瘤二维声像图和彩色多普勒变化,计算肿瘤体积和瘤体倍增时间,描绘各组治疗中肿瘤生长曲线;观察肿瘤病理改变特征。4.卡铂微球诱导大鼠皮下移植瘤细胞凋亡及对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响本研究应用免疫组化及细胞凋亡原位检测技术（TUNEL法）检测肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在卡铂微球治疗大鼠皮下移植肿瘤中的表达。结果1.体外释放研究结果显示卡铂PLGA微球在初期释放无突释效应,第1天后缓慢释放,第2～12天之间微球几乎以恒定的速度释放药物,第13天加速释放,第14天释放释放减慢趋于稳定,曲线平稳。卡铂缓释微球成品在扫描电镜下光滑圆整无孔洞。PH7.4磷酸缓冲液为介质将微球放入其中,第7天微球表面有褶皱及孔洞出现。第14天微球表现皱缩,孔洞明显增加。第21天微球皱缩及孔洞范围更加广泛。因此,缓释液中微球随降解时间延长微球表面皱缩及孔洞也随之增加。2. Walker-256肿瘤腹水于SD大鼠右后腿内侧皮下接种能成功建立大鼠皮下移植瘤模型。该模型制作简单、价廉、肿瘤生长稳定、自然生存期达50d以上。肿瘤接种后第30天以内大鼠不出现皮肤破溃和腹水,肿瘤声像图表现为边界清晰的单一低回声结节、彩色血流信号丰富;接种后第7天肿瘤最大径为11.59±1.28mm。3.对比各组大鼠的肿瘤体积、生长曲线和瘤体倍增时间,第21天的观察期内微球组肿瘤生长持续受到抑制,卡铂组仅在给药后的前7天为明显的抑制作用,以后逐渐消失;而微球组在各时间段表现为持续的肿瘤抑制作用,前3天微球组抑制作用略弱于卡铂组,后4天抑制作用略强于卡铂组但差异无统计学意义。第714天及1421天微球组对肿瘤抑制作用持续存在,强于卡铂组,差异有统计学意义,此时卡铂组与对照组和盐水组相比抑制作用差异无统计学意义。表明微球对肿瘤的抑制作用持久,能提高疗效。声像图显示各治疗组肿瘤内部血流明显减少,微球组治疗后肿瘤内部呈不均质高回声,部分肿瘤后期出现液化坏死;卡铂组及对照组回声变化不明显。肿瘤病理观察可见,各治疗组肿瘤内均可见大片凝固性坏死区。4.通过TUNEL法检测,微球组随各时间点的增加凋亡指数也跟随着各时间点的变化明显升高,而卡铂组随时间点的增加凋亡指数则明显减低。微球组的大鼠肿瘤组织中的BcL-2基因蛋白表达明显低于其他各组,而Bax基因蛋白表达明显高于其他各组,其肿瘤细胞的AI明显高于其他各组。结论1.卡铂-PLGA缓释微球具有一定的缓控能力。其包封的卡铂药物晶体是通过“孔洞”溶滲作用逐渐释放出微球的。2. SD大鼠右后腿内侧皮下接种Walker-256肿瘤成功率高,符合瘤内注射药物治疗研究的大鼠实体肿瘤模型。SD大鼠生长稳定、自然生存期长。3.超声引导瘤内注射卡铂微球治疗大鼠皮下移植瘤较卡铂原药组具有更明显的抑瘤效果;本实验结果表明,此治疗方法简便易行、效果显著,有望成为实体肿瘤治疗的一种新方法。4.卡铂缓释微球有较好的抗肿瘤效果,既能诱导肿瘤细胞凋亡,也能够抑制肿瘤局部细胞生长,通过BcL-2/ Bax异二聚体能更准确地反映卡铂微球对肿瘤细胞凋亡发生的程度,凋亡指数是反映出卡铂缓释微球瘤内注射具有明显抗肿瘤作用指标。